| 研究課題/領域番号 |
21K17104
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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小区分57060:外科系歯学関連
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
堀江 尚弘 北海道医療大学, 歯学部, 助教 (30802318)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | CCN2 / shRNA / 骨芽細胞 / ゲノム編集 / 口腔扁平上皮癌 / iPS細胞 / 抗がん剤 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
口腔がんに対して使用されている抗がん剤には副作用，予後不良といった問題点があるため，分子標的治療薬として新たな抗がん剤の開発が求められている。本研究では，標的因子としてCCN2に着目し，新規抗がん剤の探索を試みる。具体的には，口腔扁平上皮癌細胞にゲノム編集を施し，CCN2遺伝子発現の変化を光学的に検知可能にする。続いて，同細胞に種々の化合物を添加し，蛍光を測定して抗がん剤候補化合物を選定する。選定した化合物をがん細胞に添加し，CCN2遺伝子・タンパク質発現量を解析すると共に，細胞増殖・細胞死に及ぼす影響を評価して化合物の至適濃度を設定し，最後に候補化合物の影響をin-vivoレベルで評価する。
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| 研究実績の概要 |
本研究は結合組織増殖因子（CTGF/CCN2）に着目して，がん細胞におけるCCN2の発現機構を応用することで「新たな抗がん剤を探索すること」を目的としている．
本年度は細胞にCRISPR/Cas9 システムを応用したゲノム編集を施し，CCN2遺伝子発現をGFPの蛍光にて検知可能な，CCN2レポーター細胞を樹立することを計画していたが，まず予備検討としてCCN2遺伝子をノックダウンした際の細胞への影響を，骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞にshRNA技術を応用し解析した．
MC3T3-E1細胞にCCN2遺伝子のshRNAを施したことにより，CCN2遺伝子発現が低下した細胞株；sh(+)を樹立できた．sh(+)とshコントロール細胞；sh(-)とを比較したところ，細胞形態に明らかな違いは認めなかったが，細胞増殖能についてはsh(+)の方が低下していた．骨関連遺伝子発現(Runx2，Col1，Bglap)はsh(+)群で高発現しており，CCN2関連タンパク質であるβ-CATENIN，MRTF-Aのタンパク質量もsh(+)群で多い傾向にあった．また，骨分化誘導実験においてsh(+)群でALP陽性細胞は多く認められ，MC3T3-E1細胞におけるCCN2遺伝子のノックダウンが同細胞の骨への分化を促進していたため，CCN2は骨芽細胞の骨分化を抑制することが想定された．加えて，樹立した細胞は先行研究から推定されたCCN2関連タンパク質の発現傾向を示しており，骨分化に関与するシグナル伝達の研究・創薬研究への応用が期待される。
本進捗状況を2023年3月23日～25日に国立京都国際会館にて開催された，第22回日本再生医療学会総会にて発表した(発表表題；下顎骨発生におけるCTGFの関与について)．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は当初，新規抗がん剤候補化合物の探索に用いる，CCN2遺伝子発現の変化を光学的に検知可能な“CCN2レポーター細胞”の樹立に向け，CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を計画していた．
実際の進捗としては，CCN2遺伝子発現を変化させた際の細胞特性を解析するため，骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞にshRNA技術を用いてCCN2遺伝子をノックダウンさせ，CCN2の骨芽細胞への影響を分析した．同工程は当初の研究計画とは異なるため，進捗状況は「遅れている」と自己評価したが，CCN2レポーター細胞樹立前の基礎検討として，重要なデータとなった．
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究の推進方策として，まずはMC3T3-E1細胞におけるCCN2遺伝子のノックダウンを追試験し，データが再現性を取れるかを確認したい．続いて，CCN2遺伝子を高発現させた際の表現型の変化についても解析し，CCN2遺伝子発現の変化によるMC3T3細胞への影響を明確化することが目標である．
こうした検討を行った上で，ゲノム編集等の遺伝子組み換え技術を応用し“CCN2レポーター細胞”の樹立を試みたい．
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