| 研究課題/領域番号 |
21K17889
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分63020:放射線影響関連
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
日下部 将之 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 助手 (40899019)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
2024年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2021年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
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| キーワード | 色素性乾皮症 / ヌクレオチド除去修復 / クロマチン / ヒストン修飾 / 自己集合 / ヒストン脱アセチル化 / DNA損傷認識 / 遺伝子 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ヌクレオチド除去修復(NER)は紫外線・化学物質など環境因子によって生じるDNA損傷を認識・除去する生体防御機構である。損傷認識因子XPCが損傷と相互作用することによりNER反応は開始されるが、真核生物のゲノムDNAは高次クロマチン構造を形成して核内に収納されており、生体内においてXPCが損傷を効率よく認識する機構は未だに不明な点が多い。申請者はこれまでに、高次クロマチン構造においてXPCの損傷認識を補助することが示唆される新規相互作用因子を見出しており、これに着目することで生体内におけるXPCの損傷認識を補助する新規機構の解明が期待される。
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| 研究実績の概要 |
本研究は、ゲノム全体を対象としたヌクレオチド除去修復の損傷認識を担うXPCタンパク質に焦点をあて、生体内においてXPCの損傷認識を補助する新規因子の同定・機能解明を目的としている。令和4年度は、目的タンパク質を特定のゲノム領域に繋留するLacO-LacIテザリングシステムを用いて、XPCの呼び込みを引き起こす因子の探索・解析を実施した。
先行研究において、XPCは非アセチル化ヒストンH3と直接相互作用し、この相互作用がアセチル化修飾の導入によって減弱すること、さらにヒストン脱アセチル化酵素の係留によってXPCの呼び込みが引き起こされたことから、XPCの損傷部位への呼び込みはヒストンアセチル化修飾によって負に制御されることが示されていた。そこで次に、XPCの呼び込みを制御する他のヒストン修飾が存在する可能性を考え、様々なクロマチン関連因子を繋留したところ、主に転写抑制に関与することが知られているH3K9メチル基転移酵素EHMT1の繋留によって、XPCの呼び込みが引き起こされることが見出された。
また、XPCの呼び込みを引き起こす因子を探索する過程において、予想外なことにXPC自身を繋留することによって、繋留していないXPC分子も呼び込まれることが見出された。様々なXPC欠失変異体を繋留させ、XPCの呼び込みに必要な機能領域の探索を行なった結果、XPCのC末端側領域を欠失することによって繋留していないXPCの呼び込みが大きく減弱することが示された。この結果から、XPCはC末端側領域を介して分子間相互作用し、自己集合する性質があることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和4年度はLacO-LacIテザリングシステムを用いて、(1) XPCの呼び込みを制御するヒストン修飾、(2) XPCの自己集合機構、二つの解析を実施し、下記のような結果を得ている。
(1) ヒストン脱アセチル化酵素以外にXPCの呼び込みを引き起こす因子として、転写抑制に関与するH3K9メチル基転移酵素EHMT1を見出した。研究代表者は先行研究において、ヒストン脱アセチル化酵素HDAC1/2がXPCの損傷認識を補助する因子であることを報告しており、これらの結果を合わせると、主に転写抑制に関与する複数のクロマチン関連因子がXPCの損傷認識にはむしろ補助的に働くことが示唆された。
(2) XPCを繋留することによって、繋留されていないXPC分子も繋留部位に呼び込まれることが見出された。この結果はXPCは自己集合する性質があることを示唆しており、損傷部位近傍においてXPCは正のフィードバック的に分子数を上昇させることで、損傷を効率よく認識するという新しい補助機構の存在が示唆された。
以上のように、予定されたLacO-LacIテザリングシステムを用いることでXPCの損傷認識を制御する因子の探索・解析は着実に進んでいると考えられる。さらに、(1)の結果は、転写制御への関与が中心に研究されてきた転写抑制性ヒストン修飾の新しい機能性解明に資すると考えられ、エピジェネティクス研究分野への波及効果も期待される。以上より、令和4年度の研究進捗は順調に進展していると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、令和4年度の研究で見出されたXPCの呼び込みを引き起こす因子に着目し、どのような分子機構によってXPCを呼び込むか、またXPCの損傷認識にこれらの因子が関与するか解析する予定である。転写抑制性ヒストン修飾に関しては、これらの修飾を導入した合成ヒストンペプチドと昆虫細胞から発現・精製したXPCタンパク質を用いて、ヒストン修飾の有無によってXPCとヒストンとの相互作用が変化するか解析する。また並行して、EHMT1の発現抑制を行うことで、XPCの損傷部位への集積に影響が生じるか、生細胞イメージングにより解析する。XPCの分子間相互作用の解析に関しては、XPCのC末端領域のみで分子間相互作用に十分であるか、引き続きLacO-LacIテザリングシステムにより詳細に解析する。さらに並行して、昆虫細胞を用いてXPCの欠失変異体を発現・精製することで、XPCの分子間相互作用を生化学的に解析する実験系の構築も目指す。
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