| 研究課題/領域番号 |
21K19063
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| 研究種目 |
挑戦的研究(萌芽)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
中区分38:農芸化学およびその関連分野
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
宮腰 昌利 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (60755809)
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| 研究期間 (年度) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
2023年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円)
2022年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
2021年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
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| キーワード | 転写後調節 / small RNA / 3'UTR / オペロン / 代謝 / 3´UTR |
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| 研究開始時の研究の概要 |
先行研究により、大腸菌・サルモネラのTCAサイクル酵素群をコードするsucABCDオペロンmRNAの3´UTRと、酢酸代謝経路をコードするackA-ptaオペロンmRNAの5´UTRが塩基対形成することを明らかにした。リボソームはトランス翻訳機構によりmRNA分子間を乗り換えて翻訳を継続することが可能である。sucABCD mRNAとackA-pta mRNAが実際に大腸菌細胞内で共局在していることを1分子FISH法で解析し、トランス翻訳機構が2分子のmRNA間でも成立することを検証する。
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| 研究実績の概要 |
原核生物のオペロンmRNAは複数のタンパク質をポリシストロニックにコードするだけでなく、その3´UTRから遺伝子発現制御能を持つsmall RNA (sRNA) を生成する。単独の転写産物として発現する通常のsRNAは、多くの場合標的mRNAの5´UTRと塩基対形成して、翻訳阻害もしくはmRNA分解を引き起こす。本研究は、mRNAの3´UTRからプロセシングを経て生成するsRNAが通常のsRNAと同様に、実際に細胞内で標的mRNAと塩基対形成するのか、もしくは3´UTRに制御配列を持つmRNA自体が標的mRNAと塩基対形成することが可能であるかを検証する。
共焦点レーザー走査型顕微鏡、活性化確率的光学再構築顕微鏡 (dSTORM)を用いてRNA局在を解析した。大腸菌の3´UTRプロセシングに必須のエンドリボヌクレアーゼであるRNase Eの野生株もしくは温度感受株を比較したところ、プロセシングの阻害によって制御性3´UTRと標的5´UTRの共局在性が減少する傾向にあることが示された。しかしながら、制御性3'UTRの標的5´UTRとの塩基対形成に必須の塩基を置換しても共局在性に変化が見られなかった。したがって、本研究の手法ではRNAの局在が定量的に解析できない可能性が示唆された。
mRNAの3´UTRからのプロセシングが制御性3´UTR由来sRNAによる標的遺伝子の制御に必須であるかを検証するため、mRNAの終止コドン直下流のRNase E切断サイトに塩基置換を導入した。3'UTRがmRNAから切り離されない状態では標的遺伝子の抑制が起きないことをウェスタンブロットで明らかにした。したがって、3´UTRに制御配列を持つmRNAではなく、切り離されたsRNAが標的mRNAと塩基対形成することで転写後調節が起きることが示された。この研究成果は論文の一部として2022年11月に発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
mRNA 3´UTR由来sRNAが標的遺伝子の転写後調節を行うためにはプロセシングが必須であり、3'UTRがmRNAから切り離されない状態では標的遺伝子の抑制が起きないことを当初計画していた実験手法とは異なる戦略で明らかにすることができた。また、研究成果を論文の一部として2022年11月にeLifeに発表した。
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| 今後の研究の推進方策 |
複数のmRNA 3'UTR由来sRNAが機能解析されているが、本研究で3'UTRのプロセシングが転写後調節に必須である一例を示すことができた。今後は、mRNAの終止コドンと3'UTRの制御領域の距離が異なる他の遺伝子座についても解析を進める。
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