ネイティブ質量分析による未精製膜タンパク質の特性解析法の構築

• 研究課題/領域番号: 21K19236
• 研究種目: 挑戦的研究(萌芽)
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 中区分43:分子レベルから細胞レベルの生物学およびその関連分野
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 明石 知子 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (10280728)
• 研究期間 (年度): 2021-07-09 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円); 2023年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円); 2022年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円); 2021年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
• キーワード: 膜タンパク質 / ネイティブ質量分析 / タンパク質複合体

研究開始時の研究の概要

現在利用されている低分子の薬剤のおよそ3割が、膜タンパク質であるG-protein coupled receptor(GPCR)をターゲットとしていると言われている。そのためGPCRと薬物複合体の構造解析や結合親和性の解析は、創薬を進めるにおいて重要な位置づけにある。本研究では、膜タンパク質の中でも不安定なGPCRに対して、特異的に結合する薬剤候補化合物を迅速に見出すための手法としてネイティブ質量分析を用いた実験手法を構築することを目指す。精製されミセル化されたGPCRでの実験系を構築した後、膜画分でミセル化していない未精製GPCRでの実験系の構築を試みる。

研究実績の概要

本課題の最終目標は、膜タンパク質を大量発現系で調製後、精製せずに膜に結合したままの状態で取り上げ、候補化合物との結合の解析を行うための高スループットなネイティブ質量分析（MS）による実験系の構築である。それには高純度の試料で、従来法で問題なく実験が行えるサンプルであることを確認する必要がある。そこで、昨年度までに、精製した2つの膜タンパク質（大腸菌および海洋性細菌由来膜内亜鉛メタロプロテアーゼRseP、ヒトβ2型アドレナリン受容体β2AR）について、ネイティブ質量分析を行うための条件をほぼ確立し、従来法でイオンが観測できることを確認した。この結果をもとに、新たにケモカインIL-8の受容体CXCR1の阻害剤のスクリーニング系の構築を視野に、まずIL-8とCXCR1の複合体の観測を試みた。IL-8は大腸菌の発現系で、CXCR1は昆虫細胞の発現系で調製し、実験に供した。IL-8とCXCR1の結合界面は広いことから、安定な複合体の観測を期待して実験を行った。IL-8を発現・精製後、IL-8は単独では基本的に二量体で存在していることをネイティブ質量分析で確認した。このIL-8をCXCR1の精製時には共存させ、不安定なCXCR1の安定化に努めて調製した。しかしながら、CXCR1の安定性が予想以上に低く、これまでIL-8とCXCR1での複合体のイオンの観測には成功していない。
また、RsePを単離精製後、生体膜環境により近いリポソームに組み込み、ネイティブMSで観測する実験に着手した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

GPCRは試料調製において発現量が少ないうえに扱いが難しく、実験にてこずっているため。

今後の研究の推進方策

扱っている膜タンパク質の中で、比較的安定なRsePについて、未精製の状態で取り上げてネイティブ質量分析を行うことを試みる。このRsePについてはリポソームに組み込む実験もさらに進める。IL-8とCXCR1の複合体の観測では、より安定化させるminiGタンパク質との三者複合体で安定に試料調製できること、そしてそのネイティブMSの実験が行える実験系を確立する。

研究成果

• [雑誌論文] Solvent effect on the detection of peptides and proteins by nanoelectrospray ionization mass spectrometry: Anomalous behavior of aqueous 2-propanol (2024)
  • 著者名/発表者名: Ninomiya Satoshi、Rankin-Turner Stephanie、Akashi Satoko、Hiraoka Kenzo
  • 雑誌名: Analytical Biochemistry 巻: 688 ページ: 115461-115461
  • DOI: 10.1016/j.ab.2024.115461
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Evaluation of Drug Responses to Human β2AR Using Native Mass Spectrometry (2023)
  • 著者名/発表者名: Tajiri Michiko、Imai Shunsuke、Konuma Tsuyoshi、Shimamoto Keiko、Shimada Ichio、Akashi Satoko
  • 雑誌名: ACS Omega 巻: 8 号: 27 ページ: 24544-24551
  • DOI: 10.1021/acsomega.3c02737
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural basis of CXC chemokine receptor 1 ligand binding and activation (2023)
  • 著者名/発表者名: Ishimoto Naito、Park Jae-Hyun、Kawakami Kouki、Tajiri Michiko、Mizutani Kenji、Akashi Satoko、Tame Jeremy R. H.、Inoue Asuka、Park Sam-Yong
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 14 号: 1 ページ: 4107-4107
  • DOI: 10.1038/s41467-023-39799-2
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Histone H3 lysine 27 crotonylation mediates gene transcriptional repression in chromatin (2023)
  • 著者名/発表者名: Liu, N, Konuma, T, Sharma, R, Wang, D, Zhao, N, Cao, L, Ju, Y, Liu, D, Wang, S, Bosch, A, Sun, Y, Zhang, S, Ji, D, Nagatoishi, S, Suzuki, N, Kikuchi, M, Wakamori, M, Zhao, C, Ren, C, Zhou, TJ, Xu, Y, Meslamani, J, Fu, S, Umehara, T, Tsumoto, K, Akashi, S, Zeng, L, Roeder, RG, Walsh, MJ, Zhang, Q, Zhou, MM
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 83 号: 13 ページ: 2206-2221.e11
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2023.05.022
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Native Mass Spectrometry of BRD4 Bromodomains Linked to a Long Disordered Region (2022)
  • 著者名/発表者名: Azegami Nanako、Taguchi Rina、Suzuki Noa、Sakata Yusuke、Konuma Tsuyoshi、Akashi Satoko
  • 雑誌名: Mass Spectrometry 巻: 11 号: 1 ページ: A0110-A0110
  • DOI: 10.5702/massspectrometry.A0110
  • ISSN: 2186-5116, 2187-137X
  • 年月日: 2022-12-28
• [雑誌論文] Mechanistic insights into intramembrane proteolysis by E. coli site-2 protease homolog RseP (2022)
  • 著者名/発表者名: Imaizumi Yuki、Hirata Kunio、Nogi Terukazu et al.
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 8 号: 34
  • DOI: 10.1126/sciadv.abp9011
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Hybrid in vitro/in silico analysis of low-affinity protein-protein interactions that regulate signal transduction by Sema6D (2022)
  • 著者名/発表者名: Tanaka Tsubasa、Ekimoto Toru、Nagatomo Meri、Neyazaki Makiko、Shimoji Erena、Yamane Tsutomu、Kanagawa Sakura、Oi Rika、Mihara Emiko、Takagi Junichi、Akashi Satoko、Ikeguchi Mitsunori、Nogi Terukazu
  • 雑誌名: Protein Science 巻: 31 号: 11
  • DOI: 10.1002/pro.4452
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mechanistic insights into intramembrane proteolysis by E. coli site-2 protease homolog RseP (2022)
  • 著者名/発表者名: Imaizumi Yuki, Yokoyama Tatsuhiko et al., （23人中11番目）
  • 雑誌名: bioRxiv 巻: -
  • DOI: 10.1101/2022.01.31.478169
  • オープンアクセス
• [学会発表] ネイティブ質量分析によるGタンパク質共役受容体（GPCR）の薬剤応答評価 (2023)
  • 著者名/発表者名: 田尻道子，今井俊輔，小沼剛、島本啓子、嶋田一夫，明石知子
  • 学会等名: 第71回質量分析総合討論会
• [学会発表] 静電および疎水性相互作用を考慮した気相粗視化分子シミュレーション法の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 七種和美，渕上壮太郎，明石知子
  • 学会等名: 第71回質量分析総合討論会
• [学会発表] ペプチドのNa+付加イオン：どの酸性サイトが脱プロトン化するか？ (2023)
  • 著者名/発表者名: 二宮啓，Dilshadbek T. Usmanov, Stephanie Rankin-Turner, 明石知子，平岡賢三
  • 学会等名: 第71回質量分析総合討論会
• [学会発表] 膜内切断プロテアーゼRsePのネイティブ質量分析による特性解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 田尻道子，志田智哉、禾晃和，明石知子
  • 学会等名: 第2回生命金属科学シンポジウム
• [学会発表] 亜鉛結合タンパク質ヒトSirtuin2の二量体化と脱アセチル化活性の解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 鈴木のあ、小沼剛、明石知子
  • 学会等名: 第2回生命金属科学シンポジウム
• [学会発表] ヒトSirtuin2の二量体化と脱アセチル化活性の関係 (2023)
  • 著者名/発表者名: 鈴木のあ、小沼剛、明石知子
  • 学会等名: 第23回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] 小胞体ストレスセンサーIRE1の多量体形成ポテンシャルとストレス感知 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松﨑元紀、横山武司、次田篤史、金村進吾、田尻道子、明石知子、野井健太郎、齋尾智英、稲葉謙治、奥村正樹
  • 学会等名: 第23回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] 静電および疎水性相互作用を考慮した粗視化分子動力学シミュレーションによる気相構造解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 七種和美、明石知子、渕上壮太郎
  • 学会等名: 第23回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] 薬物スクリーニングを目指した生細胞内タンパク質の直接質量分析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 明石知子
  • 学会等名: 第49回BMSコンファレンス
• [学会発表] システイン残基の酸化に伴うSOD1のミスフォールディングと筋萎縮性側索硬化症 (2023)
  • 著者名/発表者名: 吉田 萌乃、明石 知子、田尻 道子、村木 則文、古川 良明
  • 学会等名: 第35回生物無機化学夏季セミナー
• [学会発表] システイン残基の酸化に伴うSOD1のミスフォールディングと筋萎縮性側索硬化症 (2023)
  • 著者名/発表者名: 吉田 萌乃、明石 知子、田尻 道子、村木 則文、古川 良明
  • 学会等名: メタルバイオサイエンス研究会2023
• [学会発表] Binding analysis of dynamic combinatorial libraries for Galection-3 by native mass spectrometry (2023)
  • 著者名/発表者名: Rina Taguchi, Kazuki Hoshi, Akira Katsuyama, Satoshi Ichikawa, Satoko Akashi, Tsuyoshi Konuma
  • 学会等名: 3rd International BMS Symposium 2023 in Kyoto
  • 国際学会
• [学会発表] 基質取り込み機構の解明に向けた膜内切断プロテアーゼRsePの構造多型解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 旭 紀久子、有賀理江、廣瀬 未果、田尻 道子、安達友里子、田中 ゆかり、明石 知子、加藤貴之、禾 晃和
  • 学会等名: 令和5年（2023年）度日本結晶学会年会
• [学会発表] 小胞体ストレスセンサーIRE1によるストレス感知と越膜シグナル変換の分子機構 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松崎 元紀, 横山 武司, 次田 篤史, 金村 進吾, 田尻 道子, 明石 知子, 野井 健太郎, 齋尾 智英, 稲葉 謙次, 奥村 正樹
  • 学会等名: 第96回日本生化学会大会
• [学会発表] Characterization of the intramembrane-cleaving protease RseP by native mass spectrometry (2023)
  • 著者名/発表者名: Michiko Tajiri, Tomoya Shida, Terukazu Nogi, Satoko Akashi
  • 学会等名: 第61回日本生物物理学会年会
• [学会発表] 化合物スクリーニングを目指した1細胞ネイティブ質量分析手法の構築 (2023)
  • 著者名/発表者名: 鈴木のあ、坂本和香、小沼剛、明石知子
  • 学会等名: 第46回日本分子生物学会年会
• [学会発表] 質量分析の基礎 (2022)
  • 著者名/発表者名: 明石知子
  • 学会等名: 第8回蛋白質工学研究会ワークショップ『蛋白質の質量分析・質量計測の基礎と応用』
  • 招待講演
• [学会発表] 質量分析によるタンパク質複合体の解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 明石知子
  • 学会等名: 第8回蛋白質工学研究会ワークショップ『蛋白質の質量分析・質量計測の基礎と応用』
  • 招待講演
• [学会発表] ネイティブ質量分析による膜タンパク質RsePと亜鉛・阻害剤の結合状態の解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 志田智哉、田尻道子，禾晃和，明石知子
  • 学会等名: 第70回質量分析総合討論会
• [学会発表] Gタンパク質共役受容体（GPCR）の作動薬・拮抗薬をスクリーニングするネイティブ質量分析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 田尻道子，今井俊輔，小沼剛、島本啓子、嶋田一夫，明石知子
  • 学会等名: 第70回質量分析総合討論会
• [学会発表] 膜内切断プロテアーゼRsePのネイティブ質量分析による特性解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 志田智哉、田尻道子，禾晃和，明石知子
  • 学会等名: 第95回日本生化学会大会
• [学会発表] ネイティブ質量分析によるGタンパク質共役受容体（GPCR）の作動薬・拮抗薬スクリーニング (2022)
  • 著者名/発表者名: 田尻道子，今井俊輔，小沼剛、島本啓子、嶋田一夫，明石知子
  • 学会等名: 第95回日本生化学会大会
• [学会発表] 小胞体ストレスセンサーの会合状態分布を介した応答制御機構の研究 (2022)
  • 著者名/発表者名: 松崎 元紀、横山 武司、次田 篤史、金村 進吾、田尻 道子、明石 知子、齋尾 智英、稲葉 謙次、奥村 正樹
  • 学会等名: 日本農芸化学会2022年度大会
• [学会発表] ネイティブ質量分析でわかること (2021)
  • 著者名/発表者名: 明石知子
  • 学会等名: 日本薬学会環境トキシコロジー若手研究者の会
  • 招待講演
• [学会発表] リガンドスクリーニングを目指したリガンド－膜タンパク質複合体のネイティブ質量分析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 田尻道子，大井里香，禾晃和，明石知子
  • 学会等名: 第94回日本生化学会
• [学会発表] 一細胞ネイティブ質量分析システムの開発 (2021)
  • 著者名/発表者名: 小沼剛、坂本和香、高野航太郎、荒井駿佑、畔上奈々子、坂田優佑、明石知子
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会年会