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中枢神経ニューロン軸索での膜タンパク質組込み履歴のin vivo可視化

研究課題

研究課題/領域番号 21K19350
研究種目

挑戦的研究(萌芽)

配分区分基金
審査区分 中区分48:生体の構造と機能およびその関連分野
研究機関大阪大学

研究代表者

岡村 康司  大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (80201987)

研究分担者 好岡 大輔  大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (00883084)
大河内 善史  大阪大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (90435818)
研究期間 (年度) 2021-07-09 – 2025-03-31
研究課題ステータス 交付 (2023年度)
配分額 *注記
6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円)
2023年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
2022年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
2021年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
キーワードイオンチャンネル / 一分子計測 / アンキリン / ホメオスタシス / ニューロン / 軸索 / エンドサイトーシス / イオンチャネル / 1分子計測 / 1分子計測
研究開始時の研究の概要

中枢神経系での電気的興奮と抑制のハブ構造である軸索初節Axon initial segment(AIS)は、錐体細胞などの中枢神経ニューロンでは抑制性ニューロンがAISに直接シナプスを形成し活動電位の発生を抑制する。生涯に亘り機能し続けるニューロンにおいてAISが調節される仕組み、特に成体での調節機構や疾患に繋がる仕組みは明らかでない。本研究では、Nav1.6-FLEXマウスを用いて、Dox依存的にCre-リコンビナーゼを介して蛍光タンパク質の種類を変化させ、新旧の分子を色で識別できるようにして単一ニューロンでAISのNav1.6が入れ替わる詳細な時空間様式をin vivoにおいて解明する。

研究実績の概要

新潟大学で作製されたNav1.6-FLExマウスを用いて組み替えが確認できるか培養系とin vivoの両方で検証をおこなった。
(1)海馬ニューロンを培養し、AAV-creウィルスベクターの感染により遺伝子組み換えを誘導した結果、AISでのNav1.6の集積が経時的に、GFP融合タンパク質(組み換え前に発現していたタンパク質)がtdTomato融合タンパク質(組み換え後に発現したタンパク質)に変化することが確認できた。
(2)stereo taxicにAAV cre ウィルスベクターを海馬に注入し、灌流固定後切片を作成し蛍光顕微鏡観察を行ったところ、GFPからtdTomatoへの置き換わりが、AISにおいて確認できた。また網膜にもAAV creウィルスベクターを注入したところ、網膜神経節ニューロンのAISと視神経のnode of Ranvierの両方で、蛍光タンパク質の変換が確認できた。
以上から、本Nav1.6-FLExマウスが当初の計画通りに、組み換えが生じる系統になっていることを確認できた。
さらに、培養海馬ニューロンの系で、定量的解析を経時的に追跡しておこなった。まず共焦点蛍光顕微鏡を用いてGFPとtdTomatoの蛍光輝度の空間分布を定量的に解析し、組み換え前の古いNav1.6タンパク質がAIS遠位側で優先的に分解され、組み換え後の新たに合成されたNav1.6タンパク質はAIS近位側へ優先的に集積する可能性が示された。またAISでのGFPタンパク質からtdTomatoタンパク質への置き換わりは、AAV-cre感染後10日ほどでほぼ完全に生じることが示された。
Nav1.6-tdTomatoの分子特性の確認については、組み換えDNAの作製に難航してきた。全合成によるプラスミドの用意を行うとともに、ヒトNav1.6プラスミドをChahine博士から供与をうけて、positive controlの解析をおこないつつある。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Nav1.6-FLExマウスが当初の計画通り組み換えが誘導できる系統になっていることを確認でき、順調に実験が進んでいる。定位脳固定装置を導入したことで安定的に海馬での組み換えを誘導することが可能になったことから、さらに実験を繰り返すことで定量的解析が可能になると期待される。
Nav1.6-tdTomatoの融合分子が、内在性のNav1.6分子と、電気生理学的特性が同じであることを確認することは、本プロジェクトの前提となる要件であり、急務と考えている。当初recombinant DNAの作製が困難であったところ、全合成による発現実験が可能になった。human Nav1.5やhuman Nav1.6をpositive controlとしてHEK293細胞でパッチクランプ計測をおこなっている。

今後の研究の推進方策

全合成によるNav1.6-tdTomatoのパッチクランプ解析による分子機能の解析は今後のマウスでの解析を軌道に乗せるための前提として重要であり、これまで以上にエフォートを割いて解析を行う予定である。ニューロンでの組み換えについては、海馬のAISが安定してAAV-creによる組み換えが誘導できるので、ageやニューロン活動依存的変化については、海馬のAISに着目して解析を進める。一方、AISとnodeとでの比較を行うには、網膜神経節細胞が形態学的には有利で海馬ニューロンは形態学的に困難であるが、眼球の硝子体へのAAV creウィルスの導入を行う通常の方法では、網膜神経節ニューロンへの感染まで数日程度もの遅延が生じるため、AISとnodeでタンパク質の入れ替わりの時間を比較することが困難であることが判明した。そこでTet-On, Tet-Offのシステムのマウスの掛け合わせを進め、ケミカルに遺伝子組み換え誘導をおこさせて、網膜神経節ニューロンなどでの解析を可能にする計画である。

報告書

(3件)
  • 2023 実施状況報告書
  • 2022 実施状況報告書
  • 2021 実施状況報告書
  • 研究成果

    (43件)

すべて 2024 2023 2022 2021

すべて 雑誌論文 (13件) (うち国際共著 3件、 オープンアクセス 13件、 査読あり 12件) 学会発表 (30件) (うち国際学会 2件、 招待講演 3件)

  • [雑誌論文] 電位依存性ホスホイノシチドホスファターゼVSP2024

    • 著者名/発表者名
      岡村 康司
    • 雑誌名

      生化学

      巻: 96 号: 2 ページ: 255-268

    • DOI

      10.14952/SEIKAGAKU.2024.960255

    • ISSN
      0037-1017
    • 年月日
      2024-04-25
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • オープンアクセス
  • [雑誌論文] Structural change of the cytoplasmic N‐terminus and <scp>S1</scp> segment of voltage‐sensing phosphatase reported by Anap2024

    • 著者名/発表者名
      Tsutsui Hidekazu、Jinno Yuka、Mizutani Natsuki、Okamura Yasushi
    • 雑誌名

      Acta Physiologica

      巻: 240 号: 5

    • DOI

      10.1111/apha.14137

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] (R)-ketamine restores anterior insular cortex activity and cognitive deficits in social isolation-reared mice2024

    • 著者名/発表者名
      Yokoyama Rei、Ago Yukio、Igarashi Hisato、Higuchi Momoko、Tanuma Masato、Shimazaki Yuto、Kawai Takafumi、Seiriki Kaoru、Hayashida Misuzu、Yamaguchi Shun、Tanaka Hirokazu、Nakazawa Takanobu、Okamura Yasushi、Hashimoto Kenji、Kasai Atsushi、Hashimoto Hitoshi
    • 雑誌名

      Molecular Psychiatry

      巻: - 号: 5 ページ: 1-11

    • DOI

      10.1038/s41380-024-02419-6

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Role of K364 next to the active site cysteine in voltage-dependent phosphatase activity of Ci-VSP2023

    • 著者名/発表者名
      Paixao Ian Costa、Mizutani Natsuki、Matsuda Makoto、Andriani Rizki Tsari、Kawai Takafumi、Nakagawa Atsushi、Okochi Yoshifumi、Okamura Yasushi
    • 雑誌名

      Biophysical Journal

      巻: - 号: 11 ページ: 2267-2284

    • DOI

      10.1016/j.bpj.2023.01.022

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書 2022 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] What voltage-sensing phosphatases can reveal about the mechanisms of ion channel regulation by phosphoinositides2023

    • 著者名/発表者名
      Okamura Yasushi、Yoshioka Daisuke
    • 雑誌名

      Biochemical Society Transactions

      巻: 51 号: 2 ページ: 827-839

    • DOI

      10.1042/bst20221065

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Insight into the function of a unique voltage-sensor protein (TMEM266) and its short form in mouse cerebellum2022

    • 著者名/発表者名
      Kawai T、Narita H、Konno K、Akter S、Andriani RT、Iwasaki H、Nishikawa S、Yokoi N、Fukata Y、Fukata M、Wiriyasermkul P、Kongpracha P、Nagamori S、Takao K、Miyakawa T、Abe M、Sakimura K、Watanabe M、Nakagawa A、Okamura Y
    • 雑誌名

      Biochemical Journal

      巻: 479 号: 11 ページ: 1127-1145

    • DOI

      10.1042/bcj20220033

    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Interaction between S4 and the phosphatase domain mediates electrochemical coupling in voltage-sensing phosphatase (VSP)2022

    • 著者名/発表者名
      Mizutani Natsuki、Kawanabe Akira、Jinno Yuka、Narita Hirotaka、Yonezawa Tomoko、Nakagawa Atsushi、Okamura Yasushi
    • 雑誌名

      Proceedings of the National Academy of Sciences

      巻: 119 号: 26 ページ: 2200364119-2200364119

    • DOI

      10.1073/pnas.2200364119

    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Voltage-sensing phosphatase (Vsp) regulates endocytosis-dependent nutrient absorption in chordate enterocytes2022

    • 著者名/発表者名
      Ratanayotha Adisorn、Matsuda Makoto、Kimura Yukiko、Takenaga Fumiko、Mizuno Tomoaki、Hossain Md. Israil、Higashijima Shin-ichi、Kawai Takafumi、Ogasawara Michio、Okamura Yasushi
    • 雑誌名

      Communications Biology

      巻: 5 号: 1 ページ: 948-948

    • DOI

      10.1038/s42003-022-03916-6

    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Spotlight on the Binding Affinity of Ion Channels for Phosphoinositides: From the Study of Sperm Flagellum2022

    • 著者名/発表者名
      Kawai Takafumi、Okamura Yasushi
    • 雑誌名

      Frontiers in Physiology

      巻: 13 ページ: 1-5

    • DOI

      10.3389/fphys.2022.834180

    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Heterologous functional expression of ascidian Nav1 channels and close relationship with the evolutionary ancestor of vertebrate Nav channels2021

    • 著者名/発表者名
      Kawai Takafumi、Hashimoto Masaki、Eguchi Natsuki、Nishino Junko M.、Jinno Yuka、Mori-Kreiner Risa、Aspaker Mans、Chiba Daijiro、Ohtsuka Yukio、Kawanabe Akira、Nishino Atsuo S.、Okamura Yasushi
    • 雑誌名

      Journal of Biological Chemistry

      巻: 296 ページ: 100783-100783

    • DOI

      10.1016/j.jbc.2021.100783

    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Engineering voltage sensing phosphatase (VSP)2021

    • 著者名/発表者名
      Tsutsui Hidekazu、Mizutani Natsuki、Okamura Yasushi
    • 雑誌名

      Methods in Enzymology

      巻: 654 ページ: 85-114

    • DOI

      10.1016/bs.mie.2021.01.003

    • ISBN
      9780128239247
    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Regulation of Neutrophil Functions by Hv1/VSOP Voltage-Gated Proton Channels2021

    • 著者名/発表者名
      Okochi Yoshifumi、Okamura Yasushi
    • 雑誌名

      International Journal of Molecular Sciences

      巻: 22 号: 5 ページ: 2620-2620

    • DOI

      10.3390/ijms22052620

    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Heterogeneity of microglial proton channel in different brain regions and its relationship with aging.2021

    • 著者名/発表者名
      Kawai T,Takao K,Akter S,Abe M,Sakimura K,Miyakawa T,Okamura Y
    • 雑誌名

      J Neurochem.

      巻: - 号: 3 ページ: 624-641

    • DOI

      10.1111/jnc.15292

    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 神経における M チャネルの活性とトラフィッキング動態の相関2024

    • 著者名/発表者名
      好岡大輔
    • 学会等名
      第101回日本生理学会大会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Voltage-sensing Phosphatase (VSP) Activity in Maturating Epidisymal Spermatozoa2024

    • 著者名/発表者名
      河合喬文、岡村康司
    • 学会等名
      先端モデル動物支援プラットフォーム(AdAMS)
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 網膜神経節細胞に着目した色変更型Nav1.6-Flexマウスを用いたNav1.6タンパクのターンオーバーの解析2024

    • 著者名/発表者名
      大河内善史、山元康平、好岡大輔、阿部学、﨑村建司、岡村康司
    • 学会等名
      先端モデル動物支援プラットフォーム(AdAMS)
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 非天然蛍光アミノ酸Anapをブローブとして用いた電位感受性酵素VSPの分子機構解明2023

    • 著者名/発表者名
      水谷夏希、岡村康司
    • 学会等名
      第61回日本生物物理学会年会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] ミクログリアに発現する電位依存性プロトンチャネルの生理機能2023

    • 著者名/発表者名
      河合喬文、岡村康司
    • 学会等名
      第115回近畿生理学談話会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Application of photocaged amino acid in elucidating lipid modulation of GABA(A) receptors.2023

    • 著者名/発表者名
      Rizki Tsari Andriani, Risa Mori-Kreiner, Natsuki Mizutani, Daisuke Yoshioka, Takafumi Kawai, Yasushi Okamura
    • 学会等名
      第115回近畿生理学談話会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Voltage-sensing phosphoinositide phosphatase;mechanisms and functions.2023

    • 著者名/発表者名
      Okamura Y, Mizutani N, Kawai T, Ratanayotha A.
    • 学会等名
      Faops2023 congress
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Single-molecule imaging to reveal a role of PI(4,5)P2-channel interaction in M-channel trafficking regulation in neurons.2023

    • 著者名/発表者名
      Yoshioka D, Okamura Y.
    • 学会等名
      Faops2023 congress
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 電位依存性プロトンチャネルHv1の2量体化はERでの滞在時間を延ばす2023

    • 著者名/発表者名
      大河内善史、神野有香、岡村康司
    • 学会等名
      第96回日本生化学会大会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] AI解析を足掛かりとした電位依存性ホスファターゼVSPの基質特異性形成機構の解明2023

    • 著者名/発表者名
      水谷夏希、二井手哲平、清水浩、岡村康司
    • 学会等名
      第96回日本生化学会大会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Physiological roles and mechanisms of voltage sensing phosphatase, VSP2023

    • 著者名/発表者名
      Okamura Y
    • 学会等名
      The 9th International Ion Channel Conference
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] H+輸送チャネル Hv1 に秘められた謎:人体と地球史軸から2023

    • 著者名/発表者名
      岡村康司、大河内善史、RIZKI TSARI ANDRIANI、水谷夏希
    • 学会等名
      日本動物学会 第94回山形大会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 神経における電位依存性カリウムチャネルの時空間動態解析2023

    • 著者名/発表者名
      好岡大輔、岡村康司
    • 学会等名
      生理研研究会「構造情報を基盤とした膜機能分子の生理機能理解に向けて」
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Activities of voltage-gated proton channels on intracellular membranes.2023

    • 著者名/発表者名
      Yasushi Okamura
    • 学会等名
      Biophysical Society Conferensces
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 神経におけるNavおよびKvチャネルの細胞内トラフィッキング機構のイメージング解析2023

    • 著者名/発表者名
      好岡大輔
    • 学会等名
      第46回日本神経科学大会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Zinc-mediated inhibition of voltage- and pH-gated Slo3 potassium channel activity2023

    • 著者名/発表者名
      Rizki Tsari Andriani, Yasushi Okamura, Takafumi Kawai
    • 学会等名
      Ion Channel Modulation Symposium
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Trafficking regulation of voltage-gated potassiumchannels associated with PI(4,5)P2 binding sites2023

    • 著者名/発表者名
      Daisuke Yoshioka, Yasushi Okamura
    • 学会等名
      The 100th Anniversary Annual Meeting of The Physiological Society of Japan
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] SINGLE MOLECULE IMAGING REVEALS A RELATIONSHIP BETWEEN PI(4,5)P2 BINDING SITES AND TRAFFICKING REGULATION OF VOLTAGE-GATEDPOTASSIUM CHANNELS2023

    • 著者名/発表者名
      Daisuke Yoshioka, Yasushi Okamura
    • 学会等名
      67th Biophysical Society Annual Meeting
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] 色変更型Nav1.6-Flexマウスを用いたNav1.6タンパクのターンオーバーの解析2023

    • 著者名/発表者名
      大河内善史、好岡大輔、阿部学、﨑村建司、岡村康司
    • 学会等名
      先端モデル動物支援プラットフォーム(AdAMS) 2022年度成果発表会
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] 神経におけるイオンチャネルの非対称的な空間動態のイメージング解析2022

    • 著者名/発表者名
      好岡大輔、岡村康司
    • 学会等名
      先端モデル動物支援プラットフォーム
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] Tracing back for ancestry of vertebrate neuronal traits : clusters of sodium channels2022

    • 著者名/発表者名
      岡村康司
    • 学会等名
      第11回国際ホヤ学会
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] SLC34 Na+/Piトランスポーターのリン酸輸送機能の理解2022

    • 著者名/発表者名
      Okochi Y, Junxian Zhou, Mizutani N, Shiozaki Y, Segawa H, Okamura Y
    • 学会等名
      第99回日本生理学会大会
    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
  • [学会発表] 電位依存性ホスファターゼにおける電位センサーと細胞質内酵素領域間の直接相互作用の解析2022

    • 著者名/発表者名
      水谷夏希,川鍋陽,岡村康司
    • 学会等名
      第99回日本生理学会大会
    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
  • [学会発表] Analysis of transport mechanism of SLC34 Na+/Pi cotransporter2022

    • 著者名/発表者名
      Zhou Junxian, Okochi Y, Mizutani N, Shiozaki Y, Segawa H, Okamura Y
    • 学会等名
      第99回日本生理学会大会
    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
  • [学会発表] 腎臓で機能するNa-Pi cotransporter SLC34A3のイオン輸送の仕組みの解明2021

    • 著者名/発表者名
      周俊先、大河内善史、水谷夏希、塩﨑雄治、瀬川博子、岡村康司
    • 学会等名
      第 113 回近畿生理学談話会
    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
  • [学会発表] Voltage-Sensing Phosphatase (VSP) Promotes Endocytosis-Dependent Nutrient Absorption in Enterocytes2021

    • 著者名/発表者名
      Adisorn Ratanayotha,Matsuda M, Kimura Y, Md. Israil Hossain, Higashijima S, Kawai T, Ogasawara M, Okamura Y
    • 学会等名
      第 113 回近畿生理学談話会
    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
  • [学会発表] 1分子イメージングによるPIP2を介したイオンチャネル動態制御の解析2021

    • 著者名/発表者名
      好岡大輔、岡村康司
    • 学会等名
      第 113 回近畿生理学談話会
    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
  • [学会発表] How are Voltage Signal and Enzyme Coupled? : S4 approaches the hydrophobic spine of the enzyme in voltage-sensing phosphatase, VSP2021

    • 著者名/発表者名
      Okamura Y
    • 学会等名
      The 8th international ion channel conference
    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] カタユウレイボヤ神経系におけるアンキリン分子の分布2021

    • 著者名/発表者名
      Okamura Y, Jinno Y, Mori R
    • 学会等名
      第92回日本動物学会
    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
  • [学会発表] 電位依存性ホスファターゼVSPの動作原理における膜酵素界面の疎水性部位の重要性2021

    • 著者名/発表者名
      水谷夏希,川鍋陽,岡村康司
    • 学会等名
      第67回日本生化学会近畿支部例会
    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書

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公開日: 2021-07-13   更新日: 2024-12-25  

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