| 研究課題/領域番号 |
21K19527
|
|---|
| 研究種目 |
挑戦的研究(萌芽)
|
| 配分区分 | 基金 |
|---|
| 審査区分 |
中区分55:恒常性維持器官の外科学およびその関連分野
|
|---|
| 研究機関 | 大阪大学 |
|---|
研究代表者 |
宮川 周士 大阪大学, 微生物病研究所, 招へい研究員 (90273648)
|
|---|
| 研究分担者 |
前田 晃 大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教員 (00319708)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-07-09 – 2024-03-31
|
| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
|
| 配分額 *注記 |
6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
2023年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
2022年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
2021年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
|
|---|
| キーワード | GGTA1 / CMAH / CRISPR/Cas3 / ブタ線維芽細胞 / Hanganutziu-Deicher抗原 / ブタ内在性レトロウイルス / 再生医療 / バイオ人工臓器 / ノックアウト / CRISPR |
|---|
| 研究開始時の研究の概要 |
バイオ人工臓器（異種移植）の分野では、当初、相同組み替え法は困難を極めたが、新法によるknockout（KO）法が我々も含めブタでも成功している。しかし、CRISPR/Cas9法には特許の問題が絡んでおり、今回研究協力者の真下知士グループが開発したCRISPR/Cas3法を応用してKO-ブタの作出を進める。現時点でブタ細胞での有効性はまだ確立されていない。ブタの繊維芽細胞、等を使って、先ずはこのCas3法で既にCas9法でKO経験のあるブタGalTと4GalNT2のKOを比較しながら行う。次に、SLA ClassI,II、とPERV(内在性レトロウイルス)-CのKOの有効性の検証を行う。
|
| 研究実績の概要 |
異種移植の開発に国産のCRISPR/Cas3法を検討している。既にCas9法でknockout(KO)経験のあるブタCMAHやb4GalNT2のKOと比較しながら、GalT(GGTA1)のKOをCas3法で進めた。まず、ブタでのgenome情報をもとにcrRNAをGGTA1の機能ドメインであるexon 9の上下に置いた（crRNA=#45と#86）。
次に、４群、①群Control (No Cascade)、②群 Cascade+Cas3+#45、③群 Cascade+Cas3+#86、④群 Cascade+Cas3+#45+#86を置いた。＜Cascade:pX-puro/Cascade (=bpNLS-Cascade)、Cas3:BPNLS-hCas3、crRNA=45:pBS-U6-crRNA=45、crRNA=86:pBS-U6-crRNA=86 ＞
これらをブタ線維芽細胞に遺伝子導入を行い、４８時間後の細胞を回収し、GSIB4を使ったFACS解析、およびゲノム抽出PCRにて解析した。
FACSの結果としては、欠損は②群、④群で多くみられた。遺伝子変異に関しては、④群で一番多く認めた。より大きなサイズの変異はこの方法では確認できなかったが、CRISPR/Cas3によるKOでブタ線維芽細胞において確かな変異（del:294 – 754bp）が確認できた。
次に、この④群 のCas3と#45-crRNA及び#8-crRNAをそれぞれpCXNに組み、pCXN/Cas3+#45-crRNA及びpCXN/Cas3+#45-crRNを作成し、これらを用いて、今度はブタ血管内皮細胞(SEC)に遺伝子導入を行い、SEC/GGTA1-KOの作出を試みた。同時にpCXN-GFPを導入し遺伝子効率を考慮しながら、再三に渡って試みるも、slectionに難渋しcloneの確立には至ってはいない。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前年度と同じになるが、CRISPR/Cas3法のブタ細胞での困難性。遺伝子導入した結果として、小さなdelしか出来ないCas9法に比して、Cas3法では、多くの場合約300bp以上のdelが発生しており、細胞の核に対してもダメージを与えていることが考えられる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
CRISPR/Cas3法を継続し、ブタ細胞を使ってGGTA1遺伝子のKO細胞等を作出する。ブタ内在性レトロウイルス(PERV)を含む、他の遺伝子にも挑戦する。
|
