ヒトオルガノイドを用いた器官発生の網羅的検討

• 研究課題/領域番号: 21K19570
• 研究種目: 挑戦的研究(萌芽)
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 中区分56:生体機能および感覚に関する外科学およびその関連分野
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 辻川 元一 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (70419472)
• 研究分担者: 秋山 雅人 九州大学, 医学研究院, 講師 (10757686) ; 佐藤 茂 大阪大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (70738525)
• 研究期間 (年度): 2021-07-09 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円); 2023年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円); 2022年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円); 2021年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
• キーワード: 器官発生 / オルガノイド / iPS細胞 / 眼分化 / ヒトiPS細胞 / 眼科学

研究開始時の研究の概要

ヒトiPS株に、ランダムミュータジェネシスを科学変異物質ENUを用いて、導入し,
ヒト眼オルガノイドであるSEAMを用いて、その形態の異常を指標として異常株の選択を行う。これに対して、ゲノム解析を行い、候補変異を同定する。これらを、ゼブラフィッシュを用いた、遺伝子操作技術により、候補変異の昨日十その正当性を実証しつつ、iPS細胞に対しても、CRSPRを用いた方法により、変異の再現をとることで、候補遺伝子を決定する。これにより、複数の眼発生に必要な遺伝子を同定することで、がん発生に関わるシグナル経路の同定を目指す。

研究実績の概要

ヒトの眼の発生機構については不明な点が多い。これは発生系譜の異なる多くの組織が集合して形成される器官のモデルが存在せず、発生期の各組織の相互作用のあり方が不明であることが原因である。我々はヒトiPS細胞から眼に関する組織の原基すべてが発生し、さらに、それが自律的に同心円状の構造を形成するSEAM法という誘導法を開発した。SEAMは発生系譜が異なる各組織が秩序だって整列する眼器官形成のモデルであるといえる。第1層は中枢神経、第二層は網膜、第三層は角膜上皮、第四層は皮膚上皮であり、第三層付近に神経堤が発生してくる。我々はこのSEAM形成を指標とした眼の発生を対象としたForward Genetics
Screeningにより、眼の発生に関わる分子の網羅的な検討を通して、現在不明である眼形成における分子（シグナル）経路を明らかにしていく。
本年度までに標準的iPS細胞株である201B7株に対して科学変異物質ENUを用いて全ゲノム上にランダムに点変異を導入する、ランダムミュータジェネシスを行った。ENUは強力な変異誘導物質であり、iPS細胞を死滅させるため、バイアビリティが落ちつつも、単細胞からスフェアを回復できるような条件を検討した。
その結果としての条件決定を行ったのと同時に、その際のプレリミナリーな導入を行った株に対して、てヒト眼オルガノイドであるSEAMを誘導し、その形態の異常を指標として異常株の選択を行うことができた。その中の一つに第2層に異常が認められる株を単離することができた。これに対して、全ゲノムシークエンス、および、誘導時期におけるｍRNAseqを行った。これによりいくつかの候補遺伝子を得た.

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

理由
第2層に異常が認められる一株について、全ゲノムシークエンスを行った。これにより、正常B7株をリファレンスとした変異を100以上同定した。
また、この株の眼誘導・発生時期、2次期におけるｍRNA seqも使用し、その二つの結果より、候補遺伝子の選定を行うことができた。

今後の研究の推進方策

候補遺伝子に対して、オルガノイド上の時空間的発現の検討、および、アノテーションされている遺伝子の機能からさらに、候補遺伝子を絞る
また、iPS細胞上でCRSPRによるノックアウト、および、過剰発現を行うことにより、表現型を再現することを目的とする。

研究成果

• [雑誌論文] 眼科領域における遺伝カウンセリングの重要性と実際 (2023)
  • 著者名/発表者名: 辻川元一
  • 雑誌名: 臨床眼科 巻: 77 ページ: 161-167
• [雑誌論文] Extensive Macular Atrophy with Pseudodrusen in a Japanese Patient Evaluated by Wide-Field OCTA (2022)
  • 著者名/発表者名: Sato Shigeru、Morimoto Takeshi、Fujikado Takashi、Tanaka Sayaka、Tsujikawa Motokazu、Nishida Kohji
  • 雑誌名: Case Reports in Ophthalmology 巻: 13 号: 3 ページ: 847-854
  • DOI: 10.1159/000526970
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] PAX6-positive microglia evolve locally in hiPSC-derived ocular organoids (2022)
  • 著者名/発表者名: Shiraki Nobuhiko、Maruyama Kazuichi、Hayashi Ryuhei、Oguchi Akiko、Murakawa Yasuhiro、Katayama Tomohiko、Takigawa Toru、Sakimoto Susumu、Quantock Andrew J.、Tsujikawa Motokazu、Nishida Kohji
  • 雑誌名: Stem Cell Reports 巻: 17 号: 2 ページ: 221-230
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2021.12.009
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Human iPS cells engender corneal epithelial stem cells with holoclone-forming capabilities (2021)
  • 著者名/発表者名: Watanabe Shinya、Hayashi Ryuhei、Sasamoto Yuzuru、Tsujikawa Motokazu、Ksander Bruce R.、Frank Markus H.、Quantock Andrew J.、Frank Natasha Y.、Nishida Kohji
  • 雑誌名: iScience 巻: 24 号: 6 ページ: 102688-102688
  • DOI: 10.1016/j.isci.2021.102688
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A hypomorphic variant in EYS detected by genome-wide association study contributes toward retinitis pigmentosa. (2021)
  • 著者名/発表者名: Nishiguchi KM, Miya F, Mori Y, Fujita K, Akiyama M, Kamatani T, Koyanagi Y, Sato K, Takigawa T, Ueno S, Tsugita M, Kunikata H, Cisarova K, Nishino J, Murakami A, Abe T, Momozawa Y, Terasaki H, Wada Y, Sonoda KH, Rivolta C, Tsunoda T, Tsujikawa M, Ikeda Y, Nakazawa T.
  • 雑誌名: Commun Biol 巻: 4 号: 1 ページ: 140-140
  • DOI: 10.1038/s42003-021-01662-9
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Drug screening with zebrafish visual behavior identifies carvedilol as a potential treatment for an autosomal dominant form of retinitis pigmentosa (2021)
  • 著者名/発表者名: Ganzen Logan、Ko Mee Jung、Zhang Mengrui、Xie Rui、Chen Yongkai、Zhang Liyun、James Rebecca、Mumm Jeff、van Rijn Richard M.、Zhong Wenxuan、Pang Chi Pui、Zhang Mingzhi、Tsujikawa Motokazu、Leung Yuk Fai
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 11 号: 1 ページ: 11432-11432
  • DOI: 10.1038/s41598-021-89482-z
• [学会発表] フックスジストロフィのリピート伸長多様性 (2023)
  • 著者名/発表者名: 山下愛理彩、辻川元一 他
  • 学会等名: 第47回日本角膜学会
  • 招待講演
• [学会発表] 角膜上皮細胞の光照射による影響 (2023)
  • 著者名/発表者名: 落合怜奈、辻川元一 他
  • 学会等名: 第47回日本角膜学会
  • 招待講演
• [学会発表] FECD のリピート伸長と表現型 (2023)
  • 著者名/発表者名: 前野紗代、辻川元一他
  • 学会等名: 第47回日本角膜学会
  • 招待講演
• [学会発表] フックス角膜内皮ジストロフィにおけるTCF4遺伝子のリピート伸長の解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 吉岡弥慎、辻川元一他
  • 学会等名: 第47回日本角膜学会
  • 招待講演
• [学会発表] CTG trinucleotide repeat expansion of TCF4 gene in Japanese Fuchs endothelial corneal dystrophy (2023)
  • 著者名/発表者名: Tsujikawa M
  • 学会等名: The 38th Asia-Pacific Academy of Ophthalmology Congress
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 膠様滴状角膜ジストロフィ (2022)
  • 著者名/発表者名: 辻川元一
  • 学会等名: 日本角膜学会
  • 招待講演