| 研究課題/領域番号 |
21K19675
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| 研究種目 |
挑戦的研究(萌芽)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
中区分58:社会医学、看護学およびその関連分野
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
奥田 貴久 日本大学, 医学部, 教授 (20620305)
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| 研究分担者 |
鉄 堅 日本大学, 医学部, 講師 (40277439)
近藤 真啓 日本大学, 歯学部, 准教授 (50312294)
橋本 悟 大分大学, 理工学部, 客員研究員 (60352150)
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| 研究期間 (年度) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円)
2023年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
2022年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
2021年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円)
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| キーワード | ロングリードシークエンサー / ナノポアテクノロジー / 個人識別 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究は、犯罪捜査や多数死体、遺骨鑑定で問題となる「混合試料からの個人識別」におけるロングリードシークエンサーの有効性を探索的に研究することを目的とする。法医鑑定の個人識別ではキャピラリー電気泳動によるSTR型検査が主流であるが、本研究では、PCRによる増幅バイアスのない全ゲノムDNAの直接ロングリードシークエンスを実施し、ショートリードと比べて遙かに長いシークエンスデータを得ることで、ショートリードでは予測精度が低かったハプロタイプ解析の正確性向上に挑戦する。そして、簡便ながら多量の情報を得ることができる第３世代シークエンス技術であるナノポアテクノロジーの個人識別への応用の可能性を探る。
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| 研究実績の概要 |
第3世代シークエンサー(MinION)の予備試験としてλ-DNAを用いたサンプル調整、ライブラリーの作製、テスト分析を実施した。これにより、MinIONの操作方法や分析法における原理について理解を深めた。
血液試料からDNA Mini Kit(キアゲン)を使用してDNA抽出及び定量を行い十分なDNA量が存在していることを確認した。その抽出したDNAからミトコンドリアDNAを選択的に取得するために、エクソヌクレアーゼV処理とエタ沈によりゲノムDNAを除去した。MinIONによるシークエンスの際の参照配列を得るためにミトコンドリアDNA全塩基配列(16kbp)を用いてサンガー法でシークエンスを試みた。今回我々は、ミトコンドリアDNAの全塩基配列をカバーするために、プライマーを21セット、さらに確認のため6セットを追加し、作製した。この結果、本実験の参照配列としての正確なミトコンドリアDNA全配列が得られた。
ヒトDNAを用いてロングPCRを実施し、そのPCR産物をMinIONでロングリードのシークエンスを行った。MinIONによるシーケンス後、読み取られた塩基配列を含むfastqファイルの品質チェックは、FastQCを用いて行った。FastQCから得られたレポートにより、シーケンスが正しく行われていることを確認した。次に、fastqファイルのデータはminimap2を用いて参照配列にマッピングを行った。マッピングされたデータは、BAM形式で保存し、必要に応じてクオリティフィルタリングを実行した。その結果、ミトコンドリアDNAの全塩基数が38kbp前後と長く検出されたため、プライマーを２セット再設定したが、いずれも38kbpであったため、再考する必要がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、Minionの取り扱いを習得するとともに、ロングリードシーケンサーが取り扱うミトコンドリアDNAの塩基配列の読み込みの正確性を検討することができたことから概ね順調であると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、昨年度とは異なり、PCRを行わないシークエンス方法について検討している。試料としてはヒト血液及び5種類の培養癌細胞から抽出したDNAから単離したミトコンドリアDNAを用い、PCRをせずに直接シークエンスを行うことを目標としている。このことにより、昨年までのロングPCRによる増幅エラーの懸念がなくなりかつ、抽出からシークエンスまでの操作の簡便化が期待できる。
今後の検討点としては、①新たなミトコンドリアDNA抽出方法の開発；血液からミトコンドリアDNAのみを抽出する方法や、ゲノムDNAの除去する方法を検討する。相対的なDNA量不足に対する解決策も検討予定である。②シークエンス用キットの変更；昨年度はMinIONのライゲーションキットについて検討したが、本年度はラピッドキットを用いる予定である。ラピッドキットはライブラリーの作製が簡便で、短時間に行うことが出来、かつミトコンドリアDNAの制限酵素による開環が必要ないため、効率的なシークエンス法と考えられる。③ヒト血液及び5種類の培養癌細胞のミトコンドリアDNA解析；新たなミトコンドリアDNA抽出方法及びそのシークエンス用キットを用いて、ヒト血液のミトコンドリアDNA解析を行う。その後、５種の癌細胞においても解析を行い、ミトコンドリアDNA解析技術の応用範囲を広げることを目指す。
以上の計画に沿って、今年度の研究を進めていく予定である。新たなミトコンドリアDNA抽出方法とシークエンス用キットの導入により、迅速かつ効率的でより正確なミトコンドリアDNA解析が期待出来る。これらの研究成果は、遺伝子疾患や個人識別研究などに貢献できると考えられる。
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