研究課題/領域番号 |
21K21346
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研究種目 |
国際共同研究加速基金(帰国発展研究)
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配分区分 | 基金 |
審査区分 |
生物学
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研究機関 | 岐阜大学 |
研究代表者 |
藤田 盛久 岐阜大学, 糖鎖生命コア研究所, 教授 (30532056)
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研究期間 (年度) |
2022-02-18 – 2025-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
57,590千円 (直接経費: 44,300千円、間接経費: 13,290千円)
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キーワード | N結合型糖鎖 / リソソーム / パウチマンノース / エキソサイトーシス / 糖加水分解酵素 |
研究開始時の研究の概要 |
リソソームは細胞内外で不要となった生体高分子の分解を行う細胞内小器官である。近年、リソソーム自体が直接、細胞膜と融合する機構「リソソーム・エキソサイトーシス」が様々な生命現象で見られる事が知られ、動的なリソソームの役割が明らかになりつつある。一方、多くの癌細胞では通常の生合成経路では形成されない短鎖N結合型(パウチマンノース)糖鎖の量が増加し、細胞表面や分泌タンパク質上の糖鎖にも検出される。本研究では、リソソーム・エキソサイトーシスを制御する因子の同定を行うとともに、短鎖N結合型糖鎖の生成機構と細胞表面へ露出する意義について遺伝学的、生化学的および細胞生物学的手法を用いて解析を行う。
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研究実績の概要 |
本研究では、哺乳動物細胞において、マンノースが3残基以下からなるN結合型糖鎖(パウチマンノース糖鎖)がどのように形成され、細胞表面へ露出されるのかを明らかにすることを目的としている。まず、HEK293、THP1、HuH7細胞からパウチマンノースを有する糖ペプチドをグライコプロテオミクス解析で同定したところ、60%以上がリソソーム由来のタンパク質であった。HuH7細胞を用いて、リソソーム局在糖加水分解酵素であるHEXAやMAN2B1の遺伝子を欠損した細胞を作出した結果、これらの細胞では、リソソーム酵素上のパウチマンノース含有量が減少した。つぎに、パウチマンノースを認識する抗体であるMannitouを用いて、細胞表面のパウチマンノースを染色した。その結果、エンドサイトーシスの阻害剤、mTORの阻害剤、カルシウム・イオノフォアでMannitouによる細胞表面染色が増加した。一方で、リソソーム・エキソサイトーシスの阻害剤であるVacuolin-1ではMannitou染色が低下した。このことから、パウチマンノース糖鎖は、リソソームで形成され、カルシウム依存的なリソソーム・エキソサイトーシスを介して細胞表面に露出していることが示唆された。さらに、リソソームの代表的なタンパク質であるLAMP1の細胞表面発現が低下する変異細胞を遺伝学的スクリーニングにより濃縮し、その責任遺伝子候補を同定した。この候補遺伝子をHuH7でノックアウトすると、LAMP1の表面発現が半分程度に減少し、リソソーム酵素の培地中への分泌も低下したことから、リソソーム・エキソサイトーシスに部分的に欠損を生じていることが示唆された。ノックアウト細胞では、Mannitouによる細胞表面染色も低下した。現在、この遺伝子について解析を進めている。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
生化学的解析により、パウチマンノース糖鎖がリソソームで形成され、リソソーム・エキソサイトーシスで細胞表面に露出することを明らかにすることができた。さらに、遺伝学的スクリーニングで、候補遺伝子を同定しており、そのノックアウトでリソソーム・エキソサイトーシスの欠損とパウチマンノース露出低下が見られたことから、引き続き解析を進めることで、リソソーム・エキソサイトーシスがどのように制御されているか明らかにできると考える。
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今後の研究の推進方策 |
引き続き、候補遺伝子の解析を行い、リソソーム・エキソサイトーシスがどのような制御を受けているか、どのような機構で細胞膜と融合するのかを明らかにする。 関連遺伝子のノックアウト細胞も作製し、表現型を確かめる。 リソソームで糖加水分解を担う酵素遺伝子についてもノックアウト細胞を作製し、パウチマンノースの形成に影響を与えるのかを確認する。 パウチマンノース糖鎖を認識するレクチンNPAを用いて、パウチマンノース糖鎖を有するタンパク質の同定とその役割について、解析を行う。
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