| 研究課題/領域番号 |
21K21350
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| 研究種目 |
国際共同研究加速基金(帰国発展研究)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
医歯薬学
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター |
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研究代表者 |
大宮 茂幹 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (40920260)
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| 研究期間 (年度) |
2022-02-18 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
57,590千円 (直接経費: 44,300千円、間接経費: 13,290千円)
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| キーワード | 自然炎症 / 心不全 / ミトコンドリアDNA / メチル化 / サイトカイン / サイトカインｍRNA |
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| 研究開始時の研究の概要 |
自然炎症は生活習慣病や神経変性疾患の発症要因となるが、心不全においても重要な要因と考えられている。
マウス圧負荷心不全モデルにおいては、心筋細胞内のトール様受容体9がミトコンドリア(mt)DNAの非メチル化CpG配列（細菌やウイルスのものと類似し炎症を惹起する）を認識し、サイトカイン産生や炎症性細胞浸潤等の炎症反応を惹起する事で心不全の発症に寄与する。
本研究では心筋細胞におけるmtDNAのメチル化や分解機構に加え、炎症性サイトカインの産生および分解制御機構に至るまで、心臓における炎症カスケードの全容を明らかにする。それによって心不全の有効な治療標的を同定し、新規治療薬の開発に繋げる。
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| 研究実績の概要 |
本研究課題においては、以下に示す4つの仮説I)、II)、III)およびIV)を証明する。
I) ミトコンドリアDNA (mtDNA) のメチル化が転写レベルや心臓における炎症反応の程度に影響を与える。II) Deoxyribonuclease II (DNase II) によるmtDNAの分解が心不全の発症および進展を抑制する。III) Tristetraprolin (TTP) によるサイトカインmRNAの分解は心不全の発症進展を抑制する。IV) NLRP3インフラマソームは心不全の発症および進展に関与する。
I)について、心臓リモデリング中に心筋細胞内のmtDNAがメチル化されるか検討するため、野生型マウスの大動脈縮窄術 (TAC) による圧負荷または左冠動脈結索による心筋梗塞 (MI) モデルの心臓サンプルを、それぞれのShamサンプルと共に収集した。TACは術後１週および４週に、MIは術後３日および２週にサンプルを収集した。mtDNAのメチル化につきバイサルファイトシークエンス法にて検討する。mtDNA methyltransferase (DNMT) 1(mtDNMT1)欠損マウスは繁殖を進めている。
II)につき心筋細胞特異的DNase II過剰発現マウスを、III)につき心筋細胞特異的TTP欠損マウスをTACに供したところ、野生型マウスに比して前者は心エコー上心拡大や心機能低下の程度が抑制されていたが、後者はそれらが悪化していた。生化学的および組織学的手法で両マウスの表現型の確定を要する。
IV) 心筋細胞特異的NLRP3欠損マウスを繁殖させている。心臓においては線維芽細胞におけるNLRP3の発現量は心筋細胞に比して多いことから、心臓線維芽細胞特異的NLRP3欠損マウスも作製して繁殖をすすめている。並行して両マウスをTACに供与して表現型を検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
I)において、野生型マウスの圧負荷心不全モデルおよび心筋梗塞モデルから不全心サンプルの収集を完了している。また、mtDNMT1欠損マウスは繁殖中である。総じて順調に進展している。
II)、 III)においてはそれぞれの遺伝子改変マウスの心不全モデルにおける表現型が、野生型マウスに比して心エコー上で有意に異なることを認めている。標的分子DNase IIおよびTTPが心不全発症進展メカニズムにおいて重要な役割を果たしていることが示唆されており、進捗状況としては順調である。
IV)に関しては心筋細胞特異的NLRP3マウスおよび心臓線維芽細胞特異的NLRP3欠損マウスの繁殖並びに心不全モデルへの供与を開始している。心臓におけるNLRP3の役割を包括的に理解する一助となるものと思われる。進捗状況としては順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
前述の仮説I)からIV)について以下に示すように研究を推進する。I) 野生型マウス不全心においてメチル化が生じているかバイサルファイトシークエンス法で検討する。また、mtDNMT1欠損マウスにTACを施し、表現型を野生型マウスと比較する。具体的には心エコーによる心拡大および心機能低下の程度、心臓および肺重量、quantitative PCR (qPCR) によるNppb mRNAレベル、組織染色によるコラーゲン沈着レベルなどを評価する。さらに、野生型マウスおよびmtDNMT1欠損マウス不全心においてmtDNAの転写活性に差を認めるかどうか，qPCRにて各mtDNA由来のmRNA発現レベルを評価する。II) 心筋細胞特異的DNase II過剰発現マウスの不全心をI)で示した生化学および組織学的手法で解析し、心不全モデルにおける同マウスの表現型を確定する。III) 心筋細胞特異的TTP欠損マウスの不全心をI)で示したように解析し、心不全モデルにおける同マウスの表現型を確定する。IV) 心筋細胞特異的または心臓線維芽細胞特異的NLRP3欠損マウスのTACによる心不全モデルにおける表現型を、I)と同様に解析して表現型を確定する。
いずれの遺伝子改変マウスにおいても野生型マウスと比較して表現型に有意な差を認めた場合、qPCRによるサイトカインmRNAの発現レベルや免疫組織染色による炎症細胞の浸潤レベルを評価する。
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