メタゲノムスクリーニングと進化分子工学的手法の融合による有用生体触媒の創製

• 研究課題/領域番号: 22360349
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 生物機能・バイオプロセス
• 研究機関: 富山県立大学
• 研究代表者: 伊藤 伸哉 富山県立大学, 工学部, 教授 (90213066)
• 研究分担者: 牧野 祥嗣 富山県立大学, 工学部, 教授 (20347355)
• 研究期間 (年度): 2010-04-01 – 2014-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2013年度)
• 配分額: 19,110千円 (直接経費: 14,700千円、間接経費: 4,410千円); 2013年度: 3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円); 2012年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2011年度: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円); 2010年度: 7,410千円 (直接経費: 5,700千円、間接経費: 1,710千円)
• キーワード: 生体触媒 / メタゲノム / スクリーニング / 光学活性アルコール / アルコール脱水素酵素 / 進化分子工学 / 進化分子アルゴリズム / 遺伝子ライブラリー / 進化アルゴリズム / 有用生体触媒

研究概要

メタゲノムからADHの類縁酵素遺伝子(par/lsadh)をPCR法にて増幅し、これらを発現ベクターにN-/C-末端近傍で融合する方法でライブラリー化する優れた手法を確立した。得られた遺伝子の解析結果から、PARでは 30個、LSADH では40個ほどの重複を除く酵素遺伝子が取得できた。PARについては、すべてホモログ（相同性が98％以上）であったが、その配列情報は進化分子工学による酵素の改変に活用できた。LSADHについては、ホモログのみならず、さまざまな新規酵素遺伝子を多数取得することができた。これらの酵素化学的な諸性質を解析し、当該ライブラリーが産業上、有用であることを証明した。

研究成果

• [雑誌論文] Use of anti-Prelog stereospecific alcohol dehydrogenase from Leifsonia and Pseudomonas for producing chiral alcohols (2014)
  • 著者名/発表者名: N.Itoh
  • 雑誌名: Appl. Microbiol. Biotechnol 巻: 98 ページ: 3889-3904
• [雑誌論文] PCR-based amplification and heterologous expression of Pseudomonas alcohol dehydrogenase genes from the soil metagenome for biocatalysis (2014)
  • 著者名/発表者名: N. Itoh, K..Isotani, Y. Makino, M. Kato, K. Kitayama, T. Ishimota
  • 雑誌名: Enzyme Microb. Technol. 巻: 55 ページ: 140-150
• [雑誌論文] Development of an improved phenylacetaldehyde reductase mutant by an efficient selection procedure (2014)
  • 著者名/発表者名: Y. Makino, N. Itoh
  • 雑誌名: Appl. Microbiol. Biotechnol 巻: 98 ページ: 4437-4443
• [雑誌論文] Use of anti-Prelog stereospecific alcohol dehydrogenase from Leifsonia and Pseudomonas for producing chiral alcohols. (2014)
  • 著者名/発表者名: N. Itoh
  • 雑誌名: Appl． Microbiol． Biotechnol． 巻: 98 号: 9 ページ: 3889-3904
  • DOI: 10.1007/s00253-014-5619-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] PCR-based amplification and heterologous expression of Pseudomonas alcohol dehydrogenase genes from the soil metagenome for biocatalysis. (2014)
  • 著者名/発表者名: N. Itoh，K. Isotani, Y. Makino, M. Kato, K. Kitayama, T. Ishimota
  • 雑誌名: Enzyme Microb． Technol． 巻: 55 ページ: 140-150
  • DOI: 10.1016/j.enzmictec.2013.10.012
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of an improved phenylacetaldehyde reductase mutant by an efficient selection procedure. (2014)
  • 著者名/発表者名: Y. Makino, N. Itoh.
  • 雑誌名: Appl． Microbiol． Biotechnol． 巻: 未定 号: 10 ページ: 4437-4443
  • DOI: 10.1007/s00253-013-5406-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Gene cloning and characterization of two NADH-dependent 3-quinuclidinone reductases from Microbacterium luteolum JCM 9174 (2013)
  • 著者名/発表者名: K. Isotani, J. Kurokawa, S. Nomoto, T. Negishi, M. Matsuda, N. Itoh
  • 雑誌名: Appl. Environ. Microbiol. 巻: 79 ページ: 1387-1384
• [雑誌論文] Efficient synthesis of optically pure alcohols by asymmetric hydrogen-transfer biocatalysis : application of engineered enzymes in a 2-propanol-water medium. Appl (2012)
  • 著者名/発表者名: N. Itoh, K. Isotani, M. Nakamura, K. Inoue, Y. Isogai, Y. Makino
  • 雑誌名: Microbiol. Biotechnol. 巻: 93 ページ: 1075-1085
• [雑誌論文] メタゲノムスクリーニング と進化分子工学的手法の融合による有用生 体触媒の創製 (2012)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 伸哉
  • 雑誌名: 日本応用酵素協会誌 巻: 46 ページ: 31-40
• [雑誌論文] Production of (R)-3-quinuclidinol by E. coli biocatalysts possessing NADH-d ependent 3- q uinuclidinone r eductase (QNR or bacC) from Microbacterium luteolum and Leifsonia alcohol dehydrogenase (LSADH) (2012)
  • 著者名/発表者名: K. Isotani, J. Kurokawa, N. Itoh
  • 雑誌名: Int. J. Mol. Sci. 巻: 13 ページ: 13542-13553
• [雑誌論文] Efficient biocatalysis for the production of enantiopure (S)-epoxides using styrene monooxygenase(SMO) and Leifsonia alcohol dehydrogenase (LSADH) system (2012)
  • 著者名/発表者名: H. Toda, R. Imae, N. Itoh
  • 雑誌名: Tetrahedron : Asymmetry 巻: 23 ページ: 1542-1549
• [雑誌論文] Production of (R)-3-ｑuinuclidinol by E. coli ｂiocatalysts ｐossessing NADH-ｄependent 3-ｑuinuclidinone ｒeductase (QNR or bacC) from Microbacterium luteolum and Leifsonia alcohol dehydrogenase (LSADH) (2012)
  • 著者名/発表者名: K. Isotani, J. Kurokawa, N. Itoh
  • 雑誌名: Int. J. Mol. Sci. 巻: 13 号: 10 ページ: 13542-13553
  • DOI: 10.3390/ijms131013542
  • 査読あり
• [雑誌論文] Efficient biocatalysis for the production of enantiopure (S)-epoxides using styrene monooxygenase (SMO) and Leifsonia alcohol dehydrogenase (LSADH) system (2012)
  • 著者名/発表者名: H. Toda, R. Imae, N. Itoh
  • 雑誌名: Tetrahedron: Asymmetry 巻: 23 号: 22-23 ページ: 1542-1549
  • DOI: 10.1016/j.tetasy.2012.09.017
  • 査読あり
• [雑誌論文] Efficient synthesis of optically pure alcohols by asymmetric hydrogen-transfer biocatalysis : application of engineered enzymes in a 2-propanol-water medium (2012)
  • 著者名/発表者名: N.Itoh, K.Isotani, M.Nakamura, K.Inoue, Y.Isogai, Y.Makino
  • 雑誌名: Applied Microbiology and Biotechnology 巻: 93 号: 3 ページ: 1075-1085
  • DOI: 10.1007/s00253-011-3447-4
  • 査読あり
• [雑誌論文] Isolation and characterization of styrene metabolism genes from styrene-assimilating soil bacteria Rhodococcus sp.ST-5 and ST-10 (2012)
  • 著者名/発表者名: H.Toda, N.Itoh
  • 雑誌名: Journal of Bioscience and Bioengineering 巻: 113 号: 1 ページ: 12-19
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2011.08.028
  • 査読あり
• [雑誌論文] メタゲノムスクリーニングと進化分子工学的手法の融合による有用生体触媒の創製 (2012)
  • 著者名/発表者名: 伊藤伸哉
  • 雑誌名: 日本応用酵素協会誌 巻: 第46号 ページ: 31-40
• [雑誌論文] Biocatalytic reduction system for the production of chiral methyl (R)/(S)-4-bromo-3-hydroxybutyrate (2010)
  • 著者名/発表者名: H. Asako, M. Shimizu, Y. Makino, N. Itoh
  • 雑誌名: Tetrahedron Lett 巻: 51 ページ: 2664-2666
• [雑誌論文] Gene cloning and characterization of dihydrolipoamide dehydrogenase from Microbacterium luteolum : A useful enzymatic regeneration system of NAD+ from NADH (2010)
  • 著者名/発表者名: J. Kurokawa, M. Asano, S. Nomoto, Y. Makino, N. Itoh
  • 雑誌名: J. Biosci. Bioeng. 巻: 109 ページ: 218-223
• [雑誌論文] Biocatalytic reduction system for the production of chiral methyl (R)/(S)-4-bromo-3-hydroxybutyrat (2010)
  • 著者名/発表者名: H.Asako, M.Shimizu, Y.Makino, N.Itoh
  • 雑誌名: Tetrahedron Lett. 巻: 51 ページ: 2664-2666
  • 査読あり
• [雑誌論文] Gene cloning and characterization of dihydrolipoamide dehydrogenase from Microbacterium luteolum : A useful enzymatic regeneration system of NAD^+ from NADH (2010)
  • 著者名/発表者名: J.Kurokawa, M.Asano, S.Nomoto, Y.Makino, N.Itoh
  • 雑誌名: J.Biosci.Bioeng. 巻: 109 ページ: 218-223
  • 査読あり
• [学会発表] PCR 法により取得したメタゲノム由来新規単鎖アルコール脱水素酵素遺伝子とその翻訳産物の諸性質 (2014)
  • 著者名/発表者名: 黒川純司, 狩谷理美, 礒谷健太郎, 伊藤伸哉
  • 学会等名: 2014年度日本農芸化学会大会
  • 発表場所: 東京
• [学会発表] S749由来アルコール脱水素酵素(LSADH) のメタゲノムスクリーニングと解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 狩谷理美,黒川純司,伊藤伸哉, Lesifonia sp
  • 学会等名: 2013年 度日本農芸化学会大会
  • 発表場所: 仙台
• [学会発表] メタゲノムを用いた酸化還元酵素遺伝子の探索とその応用 (2013)
  • 著者名/発表者名: 礒谷健太郎, 石母田剛, 加藤真輝, 黒川 純司, 牧野祥嗣, 伊藤伸哉
  • 学会等名: 2013年度日本農芸化学会大会
  • 発表場所: 仙台
• [学会発表] メタゲノムスクリーニングと 進化分子工学による有用生体触媒の創製 (2013)
  • 著者名/発表者名: 伊藤伸哉
  • 学会等名: 応用酵素協会成果発表会
  • 発表場所: 大阪
• [学会発表] メタゲノム由来フェニル アセトアルデヒド還元酵素(PAR)相同遺伝子 の配列情報と酵素の改変 (2013)
  • 著者名/発表者名: 礒谷健太郎・黒川純司・竹内奈美・牧野 祥嗣, 伊藤伸哉
  • 学会等名: 第65回日本生物工学会大会
  • 発表場所: 広島
• [学会発表] メタゲ ノムスクリーニングによる新規短鎖アルコ ール脱水素酵素遺伝子の取得とその解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 狩谷理美, 黒川純司, 伊藤伸哉
  • 学会等名: 第17回生体触媒化学シンポジウム
  • 発表場所: 岡山
• [学会発表] メタゲノム由来フェニルアセトアルデヒド還元酵素(PAR)相同遺伝子の配列情報と酵素機能の改変 (2013)
  • 著者名/発表者名: 風間美輝, 礒谷健太郎, 黒川純司, 竹内奈美, 牧野祥嗣, 伊藤伸哉
  • 学会等名: 第17回生体触媒化学シンポジウム
  • 発表場所: 岡山
• [学会発表] Lesifonia sp. S749由来アルコール脱水素酵素(LSADH)のメタゲノムスクリーニングと解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 狩谷 理美、黒川純司、伊藤伸哉
  • 学会等名: 2013年度日本農芸化学会大会
  • 発表場所: 仙台
• [学会発表] メタゲノムを用いた酸化還元酵素遺伝子の探索とその応用 (2012)
  • 著者名/発表者名: 礒谷・石母田・加藤・黒川・牧野・伊藤
  • 学会等名: 日本農芸化学会2012年度大会
  • 発表場所: 京都女子大学
  • 年月日: 2012-03-24
• [学会発表] フェニルアセトアルデヒド還元酵素(PAR)相同遺伝子のメタゲノムスクリーニングとその解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 伊藤・礒谷・竹内・牧野・大段・黒川
  • 学会等名: 日本農芸化学会2012年度大会
  • 発表場所: 京都女子大学
  • 年月日: 2012-03-24
• [学会発表] Development of novel biocatalysts for producing chiral compounds (2012)
  • 著者名/発表者名: N. Itoh
  • 学会等名: Seminar on Green Sustainable Chemistry in Tottori
  • 発表場所: Tottori, Japan
• [学会発表] フェニルアセトアルデヒド還元酵素(PAR)相同遺伝子のメタゲノムスクリーニングとその解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 礒谷健太郎, 黒川純司, 竹内奈美, 牧野 祥嗣, 伊藤伸哉
  • 学会等名: 第16回生体触媒化学シンポジウム
  • 発表場所: 富山
• [学会発表] Efficient synthesis of optically pure (S)-epoxides using Rhodococcus styrene monbooxygenase (SMO) and Leifsonina alcohol dehydrogenase (LSDH) system (2012)
  • 著者名/発表者名: N. Itoh
  • 学会等名: Enzyme Engineering XXII
  • 発表場所: Toyama, Japan
• [学会発表] Efficient synthesis of enantiopure (S)-epoxides by styrene monooxygenase of Rhodococcous sp. ST-10 (2012)
  • 著者名/発表者名: N. Itoh, R. Imae, H. Toda
  • 学会等名: 12 th Japan-Korea-China Joint Symposium on Enzyme Engineering
  • 発表場所: 富山
• [学会発表] フェニルアセトアルデヒド還元酵素（PAR)相同遺伝子のメタゲノムスクリーニングとその解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 礒谷健太郎、黒川純司、竹内奈美、牧野祥嗣、伊藤伸哉
  • 学会等名: 第16回生体触媒化学シンポジウム
  • 発表場所: 富山
• [学会発表] 3-キヌクリジノン還元酵素遺伝子のクローニングと(R)-3-キヌクリジノール生産 (2011)
  • 著者名/発表者名: 礒谷・黒川・伊藤
  • 学会等名: 第4回北陸合同バイオシンポジウム
  • 発表場所: 宇奈月国際会議場
  • 年月日: 2011-11-11
• [学会発表] Development of an efficient method for producing optically pure alcohols using an asymmetric hydrogen-transfer biocatalysis (2010)
  • 著者名/発表者名: N.Itoh, Y.Makino
  • 学会等名: Pacifichem2010
  • 発表場所: Hawaii, USA
  • 年月日: 2010-12-19
• [学会発表] メタゲノムを用いた酸化還元酵素遺伝子の探索とその応用 (2010)
  • 著者名/発表者名: 黒川、礒谷、石母田、加藤、牧野、伊藤
  • 学会等名: 第62回日本生物工学会
  • 発表場所: 宮崎市
  • 年月日: 2010-10-28
• [学会発表] Development of an efficient method for producing optically pure alcoholsusing an asymmetric hydrogen-transfer biocatalysis (2010)
  • 著者名/発表者名: N. Itoh, Y. Makino
  • 学会等名: Pacifichem2010
  • 発表場所: Hawaii, USA
• [学会発表] メタゲノム由来フェニルアセトアルデヒド還元酵素(PAR)相同遺伝子の配列情報と酵素の改変
  • 著者名/発表者名: 礒谷健太郎、黒川純司、竹内奈美、牧野祥嗣、伊藤伸哉
  • 学会等名: 第65回日本生物工学会大会
  • 発表場所: 広島
• [学会発表] メタゲノムスクリーニングと進化分子工学による有用生体触媒の創製
  • 著者名/発表者名: 伊藤伸哉
  • 学会等名: 応用酵素協会成果発表会
  • 発表場所: 大阪
• [学会発表] メタゲノム由来フェニルアセトアルデヒド還元酵素（PAR）相同遺伝子の配列情報と酵素機能の改変
  • 著者名/発表者名: 風間美輝、礒谷健太郎、黒川純司、竹内奈美、牧野祥嗣、伊藤伸哉
  • 学会等名: 第17回生体触媒化学シンポジウム
  • 発表場所: 岡山
• [学会発表] PCR法により取得したメタゲノム由来新規短鎖アルコール脱水素酵素遺伝子とその翻訳産物の諸性質
  • 著者名/発表者名: 黒川 純司、狩谷 理美、礒谷 健太郎、伊藤 伸哉
  • 学会等名: 2014年度日本農芸化学会
  • 発表場所: 東京
• [学会発表] Development of novel biocatalysts for producing chiral compounds
  • 著者名/発表者名: N. Itoh
  • 学会等名: Seminar on Green Sustainable Chemistry in Tottori, 2012.12 （Tottori, Japan）
  • 発表場所: 鳥取
  • 招待講演
• [図書] Protein engineering: development of novel enzymes for the improved reduction of C= O double bonds (2014)
  • 著者名/発表者名: N. Itoh, Y. Makino
  • 出版者: E. Brenna (ed.) in Synthetic methods for biologically active molecules. (Wiley, Germany)
• [図書] Protein engineering: development of novel enzymes for the improved reduction of C=O double bonds(In: E. Brenna (ed) Synthetic methods for biologically active molecules) (2013)
  • 著者名/発表者名: N. Itoh, Y. Makino
  • 出版者: Wiley-VCH
• [図書] 進化分子工学的手法による極性有機溶媒耐性PAR の創製と生産性の向上伏見譲(監修進化分子工学) (2013)
  • 著者名/発表者名: 伊藤伸哉
  • 出版者: NTS出版
• [図書] 進化分子工学を利用した光学活性エポキシ化合物生産プロセスの開発(伏見譲監修進化分子工学) (2013)
  • 著者名/発表者名: 戸田弘, 伊藤伸哉
  • 出版者: NTS出版
• [図書] 進化分子工学的手法による極性有機溶媒耐性PARの創製と生産性の向上 (2013)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 伸哉
  • 出版者: 伏見 譲 監修 進化分子工学 エヌ・ティー・エス
• [図書] 進化分子工学を利用した光学活性エポキシ化合物生産プロセスの開発 (2013)
  • 著者名/発表者名: 戸田弘、伊藤 伸哉
  • 出版者: 伏見 譲 監修 進化分子工学 エヌ・ティー・エス
• [図書] 酸化還元反応を利用する有用物質生産 (2010)
  • 著者名/発表者名: 伊藤伸哉, エコバイオリファイナリー
  • 出版者: シーエム シー出版
• [図書] エコバイオリファイナリー,酸化還元反応を利用する有用物質生産 (2010)
  • 著者名/発表者名: 伊藤伸哉
  • 総ページ数: 10
  • 出版者: シーエムシー出版
• [備考]
  • URL: http://www.pu-toyama.ac.jp/BR/itoh/
• [備考] 応用生物プロセス学研究室
  • URL: http://www.pu-toyama.ac.jp/BR/itoh/
• [備考]
  • URL: http://www.pu-toyama.ac.jp/BR/itoh/
• [備考]
  • URL: http://www.pu-toyama.ac.jp/BR/itoh/
• [産業財産権] 還元酵素遺伝子増幅用プライマーセット,および還元酵素遺伝子取得方法 (2013)
  • 発明者名: 伊藤伸哉, 黒川純司, 朝子弘之
  • 権利者名: 富山県, 住友化学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2013
• [産業財産権] 還元酵素遺伝子増幅用プライマーセット、および還元酵素遺伝子取得方法 (2013)
  • 発明者名: 伊藤、黒川、朝子
  • 権利者名: 伊藤、黒川、朝子
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2013-03-01
• [産業財産権] 変異型還元酵素及びその利用 (2012)
  • 発明者名: 伊藤伸哉, 朝子弘之
  • 権利者名: 富山県, 住友化学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2012
• [産業財産権] 変異型還元酵素及びその利用 (2012)
  • 発明者名: 伊藤伸哉, 朝子弘之
  • 権利者名: 富山県住友化学
  • 産業財産権番号: 2012-039796
  • 出願年月日: 2012