膜蛋白質の結晶化を促進する人工蛋白質リガンドの構築法に関する研究

• 研究課題/領域番号: 22570114
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 構造生物化学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 野村 紀通 京都大学, 大学院・医学研究科, 助教 (10314246)
• 連携研究者: 岩田 想 京都大学, 大学院・医学研究科, 教授 (60452330)
• 研究期間 (年度): 2010 – 2012
• 研究課題ステータス: 完了 (2012年度)
• 配分額: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円); 2012年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2011年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2010年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
• キーワード: 膜蛋白質 / X線結晶構造解析 / 結晶化リガンド / 抗体フラグメント / ファージディスプレイ / 膜輸送体 / プァージディスプレイ

研究概要

膜蛋白質の多くは重要な創薬ターゲットであるため,系統的かつ網羅的な精密立体構造データの蓄積が切望されているが,現在の技術水準ではX線結晶構造解析の難度はきわめて高い.膜蛋白質の結晶構造を高分解能で決定するには,膜蛋白質と特異的に結合して結晶性を向上させる人工蛋白質「結晶化リガンド(crystallizing ligand)」をテーラーメイドで作製し,膜蛋白質/結晶化リガンド複合体の良質な三次元結晶を回折実験に供するというストラテジーが有効である.本研究では,任意の膜蛋白質に対する結晶化リガンドをハイスループットで作出する新規手法を確立することを目指した。結晶化リガンドとしてはFv抗体フラグメント分子骨格を用いた。開発した技術を用いて哺乳類由来の促進拡散グルコーストランスポーター/Fv抗体フラグメント複合体の新規構造を3.5Å分解能で決定することに世界で初めて成功した。

研究成果

• [雑誌論文] G protein-coupled receptor inactivation by an allosteric inverse-agonist antibody (2012)
  • 著者名/発表者名: Hino T., et al
  • 雑誌名: Nature 巻: 482 号: 7384 ページ: 237-40
  • DOI: 10.1038/nature10750
  • 査読あり
• [雑誌論文] Platform for the rapid construction and evaluation of GPCRs for crystallography in Saccharoroyces cerevisiae. (2012)
  • 著者名/発表者名: Shiroishi M., et al.
  • 雑誌名: Micorb, Cell Fact. 巻: 11 号: 1 ページ: 78-78
  • DOI: 10.1186/1475-2859-11-78
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cloning, expression and purification of the anion exchanger 1 homologue from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium (2011)
  • 著者名/発表者名: Tokuda N, Igarashi K, Shimamura T(co-1st author), Yurugi-Kobayashi T, Shiroishi M, Ito K, Sugawara T, Asada H, Murata T, Nomura N, Iwata S, Kobayashi T.
  • 雑誌名: Protein. Expr. Purif. 巻: 79(1) 号: 1 ページ: 81-7
  • DOI: 10.1016/j.pep.2011.04.006
  • NAID: 120003255719
  • 査読あり
• [雑誌論文] Evaluation of the Pichia pastoris expression system for the production of GPCRs for structural analysis (2011)
  • 著者名/発表者名: Asada, H., Uemura, T., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Shimamura, T., Tsujimoto, H., Ito, K., Sugawara, T., Nakane, T., Nomura, N., Murata, T., Haga, T., Iwata, S., Kobayashi, T
  • 雑誌名: Microbial Cell Factories 巻: 10 号: 1 ページ: 24-24
  • DOI: 10.1186/1475-2859-10-24
  • 査読あり
• [学会発表] 膜蛋白質のX線結晶構造解析を支援する抗体工学技術の確立 (2011)
  • 著者名/発表者名: 野村紀通,他
  • 学会等名: 第84回日本生化学会大会 シンポジウム「多様な生物種における膜タンパク質の機能理解を目指した新戦略」
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2011-09-24
• [学会発表] 膜蛋白質のX線結晶構造解析を支援する抗体工学技術の確立 (2011)
  • 著者名/発表者名: 野村紀通, ら
  • 学会等名: 第84回日本生化学会大会シンポジウム「多様な生物種における膜タンパク質の機能理解を目指した新戦略」
  • 発表場所: 京都国際会館
  • 年月日: 2011-09-24
• [学会発表] 抗体フラグメントを用いたヒト膜タンパク質の結晶構造解析 (2010)
  • 著者名/発表者名: 岩田想, 野村紀通
  • 学会等名: BioJapan2014アカデミックシーズ発表会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(横浜市西区)
  • 年月日: 2010-09-29
• [産業財産権] 抗ヒトバンド3モノクローナル抗体 (2011)
  • 発明者名: 小林拓也 他
  • 権利者名: 科学技術振興機構
  • 産業財産権番号: 2011-246364
  • 出願年月日: 2011-11-10
• [産業財産権] 抗ヒトバンド3モノクローナル抗体 (2011)
  • 発明者名: 小林拓也, ら
  • 権利者名: 科学技術振興機構
  • 産業財産権番号: 2011-246364
  • 出願年月日: 2011-11-10
• [産業財産権] 膜蛋白質の立体構造を認識するモノクローナル抗体のスクリーニング方法 (2010)
  • 発明者名: 日野智也, 村田武士, 荒川孝俊, 野村紀通, 小林拓也, 岩田想
  • 権利者名: 日野智也, 村田武士, 荒川孝俊, 野村紀通, 小林拓也, 岩田想
  • 出願年月日: 2010-04-28
  • 外国