| 研究課題/領域番号 |
22H00372
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
中区分39:生産環境農学およびその関連分野
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
黄川田 隆洋 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, グループ長 (60414900)
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| 研究分担者 |
舟橋 啓 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 教授 (70324548)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2025年度)
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| 配分額 *注記 |
42,250千円 (直接経費: 32,500千円、間接経費: 9,750千円)
2025年度: 10,270千円 (直接経費: 7,900千円、間接経費: 2,370千円)
2024年度: 10,270千円 (直接経費: 7,900千円、間接経費: 2,370千円)
2023年度: 10,010千円 (直接経費: 7,700千円、間接経費: 2,310千円)
2022年度: 11,700千円 (直接経費: 9,000千円、間接経費: 2,700千円)
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| キーワード | DNA修復 / 極限乾燥耐性 / ゲノム / CRISPR / 部位特異的遺伝子導入 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究は、ネムリユスリカの乾燥・再水和の過程で生じる”DNAの障害”が、”どの場所”で生じて、”どのような因子で保護・修復”しているのかを知ることで、"乾燥耐性をもたらすDNA修復機構"の全容を解明することを目的とする。新規DNA保護・修復因子を利用することで、乾燥などのストレスに強い作物の育種や細胞を作出することが可能となる。DNA修飾活性因子を使えば、新たなゲノム編集技術への応用も期待できる。
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| 研究実績の概要 |
1. Pv11細胞を用いたDNA損傷データベース（Breakome）の構築： 前年度末に実施したPv11細胞のBLISS-seq解析のデータ処理を進め、放射線および乾燥処理に起因するDNA二本鎖切断（DSB）の分布マップを構築した。コメットアッセイにより、トレハロース処理中に大規模なDNA損傷は生じていないことが示唆されていたが、BLISS-seqの結果もこれと一致し、全ゲノムにわたる顕著な損傷は観察されなかった。一方、損傷は特定のゲノム領域に集中しており、Hi-CおよびATAC-seq解析の結果、これらの領域はオープンクロマチンに富むことが示唆された。
2. DNA保護・修復因子同定のためのCRISPRスクリーニング系の構築： Pv11細胞の全遺伝子（約2万）を網羅的に標的とするgRNAライブラリーを設計し、合成DNA断片を既存のPv11用RNA発現ベクターに組み込んだ。gRNA発現カセットをゲノムのセーフハーバー領域に単コピーで安定導入するため、CRISPR以外の部位特異的挿入技術（Flp/FRTおよびCre/loxPシステム）を導入した。
3. DNA修復機構の誘導メカニズムの解析： Pv11細胞ではトレハロース前処理により乾燥耐性が誘導されることから、RNA-seqによる網羅的発現解析を通じて誘導メカニズムを調査した。時系列解析の結果、トレハロース処理3時間後以降に、マンニトール処理とは異なる遺伝子発現軌道が観察された。この分岐に関与するモジュールは、抗酸化応答およびアポトーシス抑制に関与する可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
黄川田グループ
前年度に構築したPv11二倍体ゲノム情報に基づき、sBLISS解析により乾燥誘導中のDSBが特定領域に偏在することを明らかにした。先進ゲノム支援のサポートによりATAC-seqを追加実施し、クロマチンのアクセシビリティに関するデータも取得した。さらに、gRNAカセットを安定的にゲノム挿入可能な組換え技術の構築に成功し、今後のCRISPRスクリーニング実行に向けた基盤を整備した。今後、sBLISS、Omni-C（TAD情報）、ATAC-seqのデータを統合し、乾眠中のDNA損傷ランドスケープの全体像を明らかにする。
舟橋グループ
Pv11細胞のトレハロースおよびマンニトール処理時の時系列RNA-seqデータを用いて遺伝子発現量の定量を行なった。定量した時系列遺伝子発現量を第一主成分(PC1)、第二主成分(PC2)にプロットした結果をトレハロース処理の時系列に沿って追跡すると、3時間後にマンニトール処理6時間後の発現状態と類似したのちPC2軸の負の方向へ分岐し、最終的な発現状態へ遷移することが確認された。PC2 軸の負とPC2 軸の負の方向への分岐に対応する遺伝子発現変化に最もよく対応するモジュールを取得した結果、それぞれ抗酸化とアポトーシス抑制と関連することが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
まずは、Flp/FRTおよびCre/loxPを用いたgRNA発現カセットの単コピー挿入技術の確立と、それを用いた限定的遺伝子群でのCRISPRスクリーニングを実施する。その後、技術的成熟度に応じて全ゲノム規模のスクリーニングへと展開する。また、トレハロース処理により誘導される15種の転写因子の相互制御関係および下流ターゲット遺伝子群の機能解析を通じて、Pv11細胞の乾燥耐性獲得メカニズムの全体像を明らかにする予定である。
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