研究課題/領域番号 |
22H00403
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研究種目 |
基盤研究(A)
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配分区分 | 補助金 |
応募区分 | 一般 |
審査区分 |
中区分43:分子レベルから細胞レベルの生物学およびその関連分野
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研究機関 | 東京大学 |
研究代表者 |
西増 弘志 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (00467044)
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研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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配分額 *注記 |
42,900千円 (直接経費: 33,000千円、間接経費: 9,900千円)
2024年度: 12,350千円 (直接経費: 9,500千円、間接経費: 2,850千円)
2023年度: 12,350千円 (直接経費: 9,500千円、間接経費: 2,850千円)
2022年度: 18,200千円 (直接経費: 14,000千円、間接経費: 4,200千円)
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キーワード | RNA / 免疫 / RNAヘリカーゼ / クライオ電子顕微鏡 / helicase / innate immunity |
研究開始時の研究の概要 |
RNAヘリカーゼはATPの加水分解を利用し立体構造を変化させ、ATP依存的に二本鎖RNAと結合・解離する。RNAヘリカーゼは複数のタイプに分類され、そのうちRIG-I様RNAヘリカーゼは免疫機構において重要な役割を担っている。本研究課題では、クライオ電子顕微鏡および高速原子間力顕微鏡を用いた静的・動的な立体構造解析を行い、RIG-I様RNAヘリカーゼの多様な作動メカニズムを解明する。
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研究実績の概要 |
RNAヘリカーゼはATPの加水分解を利用し立体構造を変化させ、ATP依存的に二本鎖RNAと結合・解離する。RNAヘリカーゼは複数のタイプに分類され、そのうちRIG-I様RNAヘリカーゼは免疫機構において重要な役割を担っている。本研究課題では、クライオ電子顕微鏡および高速原子間力顕微鏡を用いた静的・動的な立体構造解析を行い、RIG-I様RNAヘリカーゼの多様な作動メカニズムを解明する。LGP2によるMDA5:RNAフィラメント形成の促進機構を明らかにするために、クライオ電子顕微鏡単粒子解析を用いてLGP2:MDA5:RNA複合体構造の決定を目指す。本年度は、研究の遂行に必要なタンパク質、RNAの調製を行い、RNAフィラメント形成条件の予備的検討を行った。先行研究を参考に、MDA5はHis×6-SUMOタグを付加した組換えタンパク質として大腸菌において大量発現させ、NiNTAカラム、ヘパリンカラム、ゲルろ過カラムを用いて高純度に精製した。LGP2はバキュロウイルス昆虫細胞発現系を用いて発現させ、カラムクロマトグラフィーを用いて同様に精製した。長鎖dsRNAはT7 RNAポリメラーゼを用いたin vitro 転写により大量合成し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。これらの精製したMDA5、LGP2、dsRNAを混合することにより、LGP2:MDA5:dsRNAヘテロフィラメント複合体が調製できることを非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。このLGP2:MDA5:dsRNAヘテロフィラメント複合体をグリッド上で瞬間凍結し、クライオ電子顕微鏡TalosArcticaを用いてデータ測定を行い、予備的な電子顕微鏡画像データを取得した。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
構造機能解析に必要なタンパク質・RNAの調製を完了し、予備的データも取得できたため。
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今後の研究の推進方策 |
今後はグリッド作製の条件を検討し、LGP2:MDA5:dsRNAヘテロフィラメント複合体の構造決定を目指す。さらに、フィラメント生成の過程を高速AFMを用いて可視化する。
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