研究課題/領域番号 |
22H00449
|
研究種目 |
基盤研究(A)
|
配分区分 | 補助金 |
応募区分 | 一般 |
審査区分 |
中区分49:病理病態学、感染・免疫学およびその関連分野
|
研究機関 | 京都大学 |
研究代表者 |
本庶 佑 京都大学, 医学研究科, 特任教授 (80090504)
|
研究分担者 |
小林 牧 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (20400690)
Begum NasimAra 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (80362507)
|
研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
|
配分額 *注記 |
42,250千円 (直接経費: 32,500千円、間接経費: 9,750千円)
2024年度: 13,650千円 (直接経費: 10,500千円、間接経費: 3,150千円)
2023年度: 13,520千円 (直接経費: 10,400千円、間接経費: 3,120千円)
2022年度: 15,080千円 (直接経費: 11,600千円、間接経費: 3,480千円)
|
キーワード | 遺伝子組換え / 抗体遺伝子組換え / エンハンサー由来RNA / 液ー液相分離 / hnRNP K / hnRNP U / R-ループ |
研究開始時の研究の概要 |
AIDに依存する抗体遺伝子組換えは、特異的かつ高効率高頻度である点、他に類をみない。AID相互作用分子と抗体遺伝子クロマチン構造変換に着目した予備実験から、抗体遺伝子座に転写依存性組換えを支えるAIDを中心とし、各種RNA結合タンパク質やnoncoding RNAを含む「転写依存的高次クロマチン組換え複合体」が構成されると仮説を立てた。本研究では転写、DNA切断と修復の両者がDNAシナプス形成の連続的相変換として進行すると考え、その複合体構成因子群を同定することを目標とする。これらの成果は抗体免疫の根幹メカニズムを解明するとともに、感染症の予防ワクチンや抗体医薬開発にも資する知見をもたらす。
|
研究実績の概要 |
DNA切断に関わるMed12とhnRNP Kについて、それぞれ以下のような新たな成果を得ることができた。Med12/eRNAによるIgH遺伝子座の長大なループ構造複合体の解析のため、IgH遺伝子の3'エンハンサーから転写されるeRNAの転写開始点と終結点を同定した。hnRNP Kのノックダウンレスキューのため、内因性hnRNP Kの発現がより少なく、またIgH遺伝子の短時間での組換え効率の良い新たなhnRNP K欠損細胞株を樹立した。また、野生型や変異型のhnRNP Kを用いてレスキュー効率などを確認した。 DNA修復に関わる因子群については、フィブリラーリンとMed19のドメイン特異的な相互作用因子を単離するため、抗体遺伝子組換えをサポートする能力のない、モチーフ変異体やドメイン欠損変異体を作成し、それらの機能を検証した。 また、RNaseH1によるR-ループを介したDNA修復に関わる構成因子の解析を進めhnRNP Uの機能を明らかにした。具体的には、hnRNP Uが古典的非相同DNA組換え (cNHEJ)の各種因子をIgH遺伝子の修復部位に集めるために作用していること、また、hnRNP UはR-ループ構成複合体にも結合し、また、IgH遺伝子の転写部位に形成されるR-ループのうち、特にG4構造にhnRNP Uが結合していた。hnRNP Uは総合して、cNHEJ を順調に進めるために必要であり、かつ、R-ループが過剰に形成されるために引き起こされる行き過ぎたDNA切断とゲノム不安定性を避けるために作用すると考えられた。
|
現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
上記のように、DNA切断と修復について、それぞれの分子で新たな発見を得ることができた。
|
今後の研究の推進方策 |
Med12とIgHのeRNAによる複合体形成の詳細を解明するために、IgH遺伝子の3'エンハンサーから転写されるeRNAに対するプローブを作成し、複合体をトラップすることにより、複合体構成因子の同定を進める。また、hnRNP Kについては、新たな欠損細胞株を用いて、SINE B1配列の分布や、IgH遺伝子との位置関係を解析する。 フィブリラーリンとMed19については、ドメインやモチーフの変異体と野生型を比較することにより、DNAシナプスや修復の複合体構成因子を同定するために、タグ付き分子によりトラップ実験を行い、回収したタンパク質やRNAを用いて、質量分析法や大規模シーケンス法により新たな責任候補分子を同定する。現在までに、有力な候補が2つ、得られているので、IgH遺伝子組換えにおけるそれらの機能を解析する。
|