研究課題/領域番号 |
22H02717
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研究種目 |
基盤研究(B)
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配分区分 | 補助金 |
応募区分 | 一般 |
審査区分 |
小区分46010:神経科学一般関連
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研究機関 | 山梨大学 |
研究代表者 |
大塚 稔久 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (40401806)
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研究分担者 |
萩原 明 東京理科大学, 理工学部応用生物科学科, 准教授 (70402849)
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研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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配分額 *注記 |
17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)
2023年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)
2022年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
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キーワード | アクティブゾーン / CAST / ELKS |
研究開始時の研究の概要 |
神経伝達物質は、学習や記憶、情動などの脳高次機能に必須の役割を果たす。しかし、伝達物質放出量の調節が、いかにシナプス伝達の強度とその可塑性をコントロールし、最終的に個体レベルでどのように表現されるのか、その本質は未だ明らかになっていない。本研究では、伝達物質放出の位置とタイミングを決定する構造体であるアクティブゾーンに着目した包括的研究を推進する。特に、アクティブゾーン構成分子CAST/ELKSが担う液-液相分離機構およびアクティブゾーン分子群の多様性に着目し、アクティブゾーンにおける分子複合体の動態制御機構の全容解明を目指す。
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研究実績の概要 |
本研究の目的はアクティブゾーンの分子構造基盤と神経伝達物質放出の変動に着目し、アクティブゾーンの核心因子であるCAST/ELKSによる分子複合体の動態制御機構を明らかにすることである。今年度では細胞レベルにおけるCAST/ELKSの液-液相分離とRIM1(Rab3-interacting molecule 1)-Rab3相互作用について総合的な解析をした。その結果、CASTとELKSは高頻度で液滴を形成したが、RIM1の液滴形成は低頻度であった。さらに、RIM1の液滴はほとんどが核で形成された。FRAP(Fluorescent Recovery After Photobleaching)による液滴流動性の評価においては、RIM1の核内液滴が最も流動性が高く、CASTが最も流動性が低い結果を得た。注目すべきことに、CASTまたはELKSとRIM1を共発現させると、RIM1の核内液滴は減少し、細胞質の液滴は著しく増加した。さらに、RIM1液滴の流動性は、CASTおよびELKSと結合することにより減少した。RIM1はRab3のエフェクターであり、CAST/ELKSが介在する液-液相分離によるRIM1-Rab3相互作用への影響を解析した。その結果、液-液相分離によりRIM1-Rab3の相互作用が促進されることがわかった。 一方、海馬ニューロンを用い、CASTとELKSの近傍に局在する因子を、近位依存性ビオチン標識法により分離・精製し、質量分析により同定した結果、およそ260因子を同定することができた。同定された因子群では、アクティブゾーン構成因子群のほか、シグナルやプロテオスタシス関連因子を含んでおり、CAST/ELKSによるアクティブゾーンサーベイランスの分子基盤として期待された。今後、詳細な解析を行う計画である。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
おおむね当初の計画通り進展しているため。特にアクティブゾーンにおける空間的プロテオミクスの系を確立できたこともあり、順調に進展していると判断した。
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今後の研究の推進方策 |
CAST/ELKSが介在する液-液相分離によるRIM1-Rab3相互作用の促進メカニズムを分子レベルで解明する。そのため、液-液相分離の阻害剤である1,6-hexanediolを添加し、CAST/ELKSが介在するRIM1の液滴形成を抑制した状況において、Rab3との相互作用がどのように変動するかを解析する。また、液-液相分離しないELKSのN末端欠失変異体と共発現させ、RIM1-Rab3相互作用を解析する。 CAST/ELKS近位依存性ビオチン標識によるプロテオーム解析では、領域を拡大し、脳組織においても同様の解析を行う。シナプスアクティブゾーン周辺部のプロテオーム情報を取得することにより、神経伝達におけるアクティブゾーンの役割を解明するための基盤を構築する。さらに、前年度実施した海馬ニューロンでの近位依存性ビオチン標識によるプロテオーム解析の結果から仮説を立て、同定因子との相互作用を評価する。 アクティブゾーンにおけるCAST/ELKSの役割を明らかにするために、海馬ニューロンでのCAST/ELKSターゲティング戦略を確立する必要がある。CAST/ELKSのダブルフロックスマウスから海馬ニューロンを培養し、Cre recombinaseを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを作製する。感染タイミング、AAVの量、感染後回収時期などを検討し、CAST/ELKS脱落によるアクティブゾーンの変動を解析する。さらに、電気生理学的解析を組み合わせることにより、構造と機能の相関性を中心的に解析する。Cre recombinase発現AAVをCAP-B10セロタイプで作製し、静脈を介した全脳感染系を樹立する。CAST/ELKS遺伝子の脱落から生じる神経変動を、生化学・免疫組織化学・電気生理学の手法を駆使し解析する。
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