| 研究課題/領域番号 |
22H04994
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| 研究種目 |
基盤研究(S)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
大区分I
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
天谷 雅行 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (90212563)
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| 研究分担者 |
松井 毅 東京工科大学, 応用生物学部, 教授 (10452442)
福田 桂太郎 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 上級研究員 (60464848)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-27 – 2027-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
193,440千円 (直接経費: 148,800千円、間接経費: 44,640千円)
2024年度: 36,920千円 (直接経費: 28,400千円、間接経費: 8,520千円)
2023年度: 37,960千円 (直接経費: 29,200千円、間接経費: 8,760千円)
2022年度: 46,150千円 (直接経費: 35,500千円、間接経費: 10,650千円)
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| キーワード | pH制御 / 機能的細胞死 / コルネオトーシス / 角層恒常性維持機構 / 皮膚微生物叢 / 角層pH三層構造 / ノンターゲットプロテオミクス / ノンターゲットリピドミクス / 無菌マウス / 黄色ブドウ球菌 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
我々の皮膚の表面を覆う角層は、角化細胞が細胞死を起こし、細胞体がある一定層堆積してできており、皮膚のバリアとして機能している。本研究では、この細胞死（コルネオトーシス）の過程を分子レベルで明らかにし、さらに、死んだ後にも分化し続け、一定の状態を維持し続けるしくみを、ｐHによる制御メカニズムに注目して、分子レベルで解明することを目指す。さらに、アトピー性皮膚炎に対し、角層pHにより皮膚微生物叢を制御した新しい治療法を考案する。
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| 研究実績の概要 |
角層pH三層（上・中・下層）構造がいかにして形成されるか、そのメカニズムを明らかにするため、
均等の圧力をテープにかけることのできる角層チェッカー用加圧装置を用いて、テープストリップを行った。そして、テープに付着した角層サンプルを用いて網羅的なタンパク解析（ノンターゲットプロテオミクス）、脂質解析（ノンターゲットリピドミクス）を行なった。その結果、テープストリップによって角層pH三層を分取することができたことを確認した。また、角層上・中・下層それぞれの層で、高発現するタンパクおよび脂質を同定した。
皮膚微生物叢が角層pH三層構造に与える影響について調べるため、角層pHイメージングマウス（SASP-Venus-mCherryマウス[VmCマウス]）に、抗生剤を全身投与したところ、角層上層のpHが酸性化した。無菌（GF）VmCマウスを作製し、角層pHイメージングを行うと角層pHがSPF下で育った（SPF）VmCマウスと比較して角層上層が酸性化していた。GFVmCマウスとSPFVmCマウスを同じケージで飼育したところGFVmCマウスの角層上層はSPFVmCマウスと同じpHに変化した。以上より皮膚微生物叢は角層上層のpHを中性化させる作用があることが示唆された。
多くの細菌は、中性（pH7.0）の環境下で最も増殖し、逆に酸性下では増殖することができないことが知られている。酸性（pH5.4）を呈する角層中層が細菌に対する影響を調べるため、角層pHとアトピー性皮膚炎の皮膚で増殖している黄色ブドウ球菌のdual ライブイメージングを行なった。その結果、定常状態では黄色ブドウ球菌は角層上層に止まっていたが、塩基性溶液を反復塗布して角層中層を中性化したマウスでは、黄色ブドウ球菌は顆粒層まで浸潤した。角層中層は黄色ブドウ球菌の侵入を防ぐバリアとして機能することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
野生型マウスにおいて、角層上・中・下層を再現性よく分離する手法を開発した。そして、得られた角層サンプルをノンターゲットプロテオミクスおよびノンターゲットリピドミクスを行うことに成功した。これにより角層上・中・下層、それぞれの層において高発現するタンパク質、脂質を同定することができるようになった。また、この手法を無菌マウスや皮膚炎マウス、魚鱗癬マウスに対して行い、その結果を比較することで、角層上層の中性化、角層中層の酸性化、角層下層の弱酸性化に関わるタンパク質や脂質の候補を絞り込むことが可能になった。
これまで表皮にplasmid DNAをplasmid injectionによって導入し、発現させていたがその発現効率は20%であった。条件検討によって80%程度と高い効率で、遺伝子を表皮に発現させることができるようになった。このplasmid injection法の改良によって、網羅的解析によって浮上した注目分子が顆粒層最上層の角化細胞（SG１細胞）の細胞死であるコルネオトーシスおよび角層pH三層構造に与える影響をより短時間かつ簡単に評価できるようになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.角層pH恒常性維持機構の解明
Sodium lauryl sulfate (SLS)、MC903・イミキモドをマウス皮膚に反復塗布すると、それぞれ、皮脂欠乏症、アトピー性皮膚炎（AD）様・乾癬様の慢性皮膚炎が誘発される。そこで、角層pHをイメージングマウス（VmCマウス）に、SLS、MC903、イミキモドを反復塗布し、角層pHライブイメージングを行い、乾燥下や炎症下で角層pH三層構造がどのように変化するか解析する。具体的には、各マウスにおいて、①角層pH三層の中で消失する層はないか、②角層上層・中層・下層のpHがコントロールと比較して異なるか調べる。さらに、保湿剤や抗炎症作用のある薬剤でどのように角層pH三層構造がどの程度、どの位の時間で変化・回復するか調べる。
2：ヒト皮膚における角層pH三層構造の形成の検証
NOGマウスに健常人の皮膚を植皮し、plasmid injection法によりpHプローブを植皮部に導入する。そして、植皮部を共焦点顕微鏡で撮影し、角層pH三層構造がマウスと同様、ヒトの皮膚においても起きているか検証する。
3：コルネオトーシスの起動シグナルの解明
SG1細胞（表皮顆粒層最上側の角化細胞）は、下層に位置するSG2細胞からシグナルを受け、コルネオトーシスを誘導するという仮説の下、SG2細胞の成熟度の指標となるタイトジャンクション（TJ）ターンオーバーとSG1細胞の細胞内Ca2+変動を解析する。そこで、TJプローブのZO-1-mCherry2と細胞内Ca2+プローブであるGCaMPを発現したZO-1 mCherry2 GCaMP（別名：ZO-1 mC2G）マウスを用いてライブイメージングを行う。また、TJの構成分子Claudin-1が表皮で欠損したZO-1mC2Gマウスのライブメージングを行い、TJがコルネオトーシスの起動に及ぼす影響を明らかにする。
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