| 研究課題/領域番号 |
22K02148
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分08030:家政学および生活科学関連
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| 研究機関 | 中村学園大学 |
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研究代表者 |
太田 千穂 中村学園大学, 栄養科学部, 准教授 (80271435)
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| 研究分担者 |
日野 真一郎 中村学園大学, 栄養科学部, 教授 (00372699)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
2,600千円 (直接経費: 2,000千円、間接経費: 600千円)
2024年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円)
2023年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
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| キーワード | ノビレチン / ポリメトキシフラボン / 潰瘍性大腸炎 / ラット / in vivo代謝 / 機能性成分 / 代謝 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、デキストラン硫酸ナトリウムで誘発させた急性期の潰瘍性大腸炎モデルラットに対して、カンキツ果皮由来成分ポリメトキシフラボン類のノビレチンまたは治療薬の5-アミノサリチル酸を経口投与による改善効果を検証し、その機序を解析することを目的とする。ノビレチンの連続経口投与による潰瘍性大腸炎に対する改善効果効果として、体重変化、組織重量、炎症サイトカイン、大腸の形態学的解析および炎症細胞浸潤の程度により評価する。また、ラット血液および尿糞中のノビレチンおよびその代謝物の定量および活性代謝物の同定を行い、臨床応用への可能性を探る。
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| 研究実績の概要 |
デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発潰瘍性大腸炎ラット(DSS病態ラット)を作製し、柑橘果皮由来成分ポリメトキシフラボン類の一種であるノビレチン(NBL)の潰瘍性大腸炎に対する効果を検証することが目的である。
SD系雄性ラット20匹を5つの群、すなわち①非DSS・対照群、②DSS・対照群、③DSS・5-ASA治療群、④DSS・低NBL治療群、⑤DSS・高NBL治療群に分けた。非DSS・対照群以外は、4％DSSを5日間自由に飲水させ、急性期のDSS病態ラットとした。6日目は一旦、通常水に戻し、7日目からは、1％DSSに切り替えるとともに、5-ASAおよびNBLを1日1回経口投与し、7日間継続した。なお、NBL治療群は、尿および糞を毎日採取し、NBL代謝物の検索を行った。尿は、酸性下で一定容量に調整後、4℃で保存した。糞は、60℃で48時間乾燥した後、粉砕し、室温にて保存した。最終投与の翌日、麻酔法により屠殺し、血液、各種臓器（大腸、肝臓、脾臓）を採取した。血液は、血清を分離し、-20℃で保存した。また、大腸は、長さを測定後、腸管内容物を洗浄し、形態学的解析を行うために、常法により4％ホルマリン-リン酸緩衝液 (pH 7.4)で固定後、パラフィンブロックを作製した。
DSS病態ラット大腸の炎症レベルは、臨床的評価(DAI)の0～3程度であった。次に5-ASAおよびNBL治療群の7日間の体重変化を調べたところ、非DSS・対照群に対し、すべての群で有意な差は見られなかった。また、肝臓重量（体重100 g当たり）は、低NBLおよび高NBL治療群のいずれでも、非DSS・対照群と比べて有意に減少した。さらに、脾臓重量（体重100 g当たり）は、非DSS・対照群と比べてDSS・対照群で有意に増加していた。なお、大腸の長さは、非DSS・対照群と比べ、もすべての群で有意な差は見られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和4年度は、動物（ラット）を用いてin vivo系試験を実施する計画であった。すなわち、SDラットを用いて、5群に分け、非DSS・対照群以外は、DSS病態ラットを作製し、5-ASA治療薬、低NBLおよび高NBLの1日1回経口投与を7日間連続継続した。投与後の尿および糞を採取し、処理後、保存している。一部、すなわち投与後1日目の尿および糞中のNBL代謝物について分析に取り掛かっているところである。屠殺後は、5群ごとの各種臓器を採取し、重量測定、大腸は長さの計測の計測と各群による比較を行った。血液についても、個体別に血清分離を行い、冷凍（-20℃）保存中である。
大腸については、形態学的解析を行うために、常法により4％ホルマリン-リン酸緩衝液 (pH 7.4)で固定後、パラフィンブロックを作製した。その一部の試料について、パラフィン切片をプレパラート作成し、ヘマトキシリン染色を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和5年度は、DSS病態ラットにおける低NBLおよび高NBL治療群の連続投与7日間における体内動態試験、すなわち、尿中および糞中におけるNBLおよびその代謝物について分析を行う。
尿中および糞中NBLおよびその代謝物の分析は、それぞれ有機溶媒を用いて超音波や振盪機で数回の抽出を行い、遠心分離で得られた上澄をろ過後、HPLCによって定量分析を行う。HPLCの分析条件は、既報に従って分析する（Koga et al., 2007, 2011）。また、NBL代謝物の同定は、LC-MSを用いて分析を行う。
大腸の形態学的解析は、作成したパラフィンブロックをミクロトームでパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン染色法等を行い顕微鏡にて粘膜破壊の程度、炎症細胞浸潤の程度を検討する。
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