| 研究課題/領域番号 |
22K04841
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分27040:バイオ機能応用およびバイオプロセス工学関連
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
二井手 哲平 大阪大学, 大学院情報科学研究科, 助教 (20802705)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | 酵素工学 / タンパク質工学 / 構造モデリング / ドッキングシミュレーション / 合理的酵素設計 / 進化 / 進化学 / 酵素 / シミュレーション / バイオインフォマティクス |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本申請では、耐熱化と基質特異性改変を目指した酵素設計のプロセス化に挑戦する。そのために、進化情報解析から配列保存度と共進化情報を取得し、これをRosetta設計時の制限パラメータとして活用する。本研究では、複数の酵素を対象に、ドライ実験(設計)とウェット実験(検証)を双方向的に実施することで汎用的かつ堅牢な酵素設計プロセスを目指す。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、設計した酵素の代謝工学応用を目指し、ドライ実験(設計)とウェット実験(検証)を双方向的に実施することで汎用的かつ堅牢な酵素設計プロセスを目指すことを目標としている。なかでも、酵素の基質・補酵素特異性を司るアミノ酸残基の同定から変換までのプロセス開発と、酵素の耐熱化を指向したアミノ酸残基の選択からin silicoスクリーニングまでの耐熱化酵素のプロセス開発の2つに取り組んでいる。
プロジェクト1年目はリンゴ酸酵素をモデル酵素として補酵素特異性に関わるアミノ酸残基の同定と特異性変換に取り組んだ。補酵素特異性決定残基の同定は、データベースから取得したアミノ酸配列を入力とした機械学習により実施した。その結果、作成した機械学習モデルは99.3%の精度でNADP依存型とNAD依存型のリンゴ酸酵素を分類することができ、さらにそのモデルの偏回帰係数を解析することでどの位置のアミノ酸残基が補酵素特異性に寄与しているかを推定することができた。次にこの結果を元に、未だ立体構造が明らかではない大腸菌由来NADP+依存型リンゴ酵素の補酵素特異性改変に取り組んだ。その結果、実用的なスクリーニング工程なしに、補酵素特異性をNAD+依存性に完全に転換することが示された。基質特異性を司るアミノ酸残基は基質ポケットの内部だけでなく、周囲の残基も補酵素特異性に大きく寄与することを示した。これらの残基は、結晶構造観察から同定することが困難であり、構造的に相同で機能的に異なる酵素のアミノ酸配列を入力データとして、高精度で推論可能な機械学習モデルを作ることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究プロジェクトの到達目標は、酵素活性を低下させずに、耐熱化と基質特異性改変を達成し、汎用かつ堅牢な酵素設計プロセスを提案することである。そのために、相同配列の取得と多重整列の統計解析から得られる変異制約パラメータを、タンパク質の設計プロセスに実装することで配列保存度と立体構造に基づく設計アルゴリズムを開発し、さらにウェット実験での結果を酵素設計プロセスへ還元することに取り組んでいる。
プロジェクト1年目はリンゴ酸酵素をモデル酵素として補酵素特異性に関わるアミノ酸残基の同定と特異性変換に取り組み、どの位置のアミノ酸残基が補酵素特異性に寄与しているかを推定することができた。加えて、未だ立体構造が明らかではない大腸菌由来NADP+依存型リンゴ酵素の補酵素特異性改変に取り組み、実用的なスクリーニング工程なしに、補酵素特異性をNAD+依存性に完全に転換することができた。これにより、酵素の基質・補酵素特異性変換に関する酵素設計の要素技術の創出に成功した。さらにこれらの研究から、酵素の基質特異性に関わるアミノ酸残基は基質ポケット外にも存在することを示唆する結果を得ることができ、新たな研究シーズを見つけることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究は、当初の計画通り酵素の基質特異性変換と耐熱化に取り組む。これまでの研究で、リンゴ酸酵素を対象に機械学習を用いることで補酵素特異性変換を達成できた。次年度は、リンゴ酸酵素以外の酵素を用いて手法の汎用性を示す。その際に、補酵素特異性だけで無く、基質特異性に関して評価する。酵素設計においては立体構造情報を利用したプロセスを追加することで、酵素発現の可能性を高めることも狙う。具体的には、タンパク質モデリングソフトを利用して、変異導入と構造評価を同時に行う計画である。これにはまず、テンプレート構造に対し、進化情報から作成する制約パラメータ値を参照してアミノ酸置換シミュレーションを実行する。結果的に得られるスコアから、安定性を示す自由エネルギー値の変化量を評価することで、安定な変異体を選抜する。最後に、基質を活性サイトに埋め込み、ドッキングシミュレーションを行い、基質との親和性の変化を評価する。条件を変えて設計した変異体を部位特異的変異法にて作製する。それぞれの変異体は、大腸菌にて発現・精製後、酵素活性を評価する。この際リガンドドッキング評価と同様、基質特異性の変化を評価する。そして、円偏光二色性分析とサーマルシフトアッセイによりTm値を算出し、熱安定性を評価する。
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