| 研究課題/領域番号 |
22K04844
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分27040:バイオ機能応用およびバイオプロセス工学関連
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| 研究機関 | 九州工業大学 |
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研究代表者 |
池野 慎也 九州工業大学, 大学院生命体工学研究科, 准教授 (20437792)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2023年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2022年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
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| キーワード | 大腸菌 / LEAペプチド / ストレス耐性 / 分子シールド機能 / 分子シールド / 環状ペプチド |
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| 研究開始時の研究の概要 |
細胞に乾燥耐性を付与するLEAタンパク質の配列をベースにLEAペプチドを設計し、それを大腸菌内で発現させると様々なストレスに対して耐性が向上することを発見し報告してきた。しかし、LEAペプチドが細胞内でどのように機能してストレス耐性を向上させるのかは明らかになっていない。本研究では以下の研究項目を実施する：
（１）LEAペプチドの機能部位の特定と分子シールド機能の解明
（２）変異導入および環状LEAペプチドの発現による高機能化
LEAペプチドが細胞内で分子シールドとして機能することを明らかにし、その機能を発展させることで、ストレス耐性向上の新しい方法論および技術の確立を目指す。
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| 研究実績の概要 |
LEAタンパク質は細胞膜の構造を安定化させ、過剰なイオン毒物から保護し、最終的に細胞内浸透圧の調整をすると報告されている。これは、発現したLEAタンパク質がストレス環境下において無秩序な構造からコイルドコイルを形成し、この構造形成により保護機能が発揮していると考えられている。この生体を保護する『分子シールド』機能はLEAタンパク質には確認されているが、その微小ドメインであるLEAペプチドが細胞内で『分子シールド』として機能しているのかは明らかになっていない。本研究では、塩ストレスにおいてLEAペプチドの配列・構造情報とストレス耐性との相関を見出すことで、細胞内で分子シールドとして機能することを明らかにし、その機能を向上させることを目的としている。
初年度は、LEAペプチド配列のアミノ酸を一つずつ非極性のアラニン (A)に置換するアラニンスキャンおよびグリシン (G) に置換するグリシンスキャン実施することで、塩ストレス耐性におけるペプチド内の機能部位の特定を行った。変異導入前のLEAペプチドを発現させた大腸菌を5%の塩濃度でストレス処理を行ったところ、コントロール株（LEAペプチド発現なし）と比較して生存数の優位性を確認した。アラニン／グリシンスキャン変異解析を行ったところ、コロニー数の減少が確認され、LEAペプチドの塩ストレス耐性の機能が低下した。しかし、12番目のグリシンをアラニンに変えた変異LEAペプチド (G12A)は、変異導入をしていないLEAペプチドを発現させたサンプルと同等の生存数であった。これは、12番目のグリシンはLEAペプチドの機能に影響を及ぼさないことを示唆しており、12番目のグリシンに別のアミノ酸に置換することによって構築した変異LEAペプチドには、塩ストレス耐性機能の向上が期待できる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
LEAペプチド配列をアラニン/グリシンで網羅的に変異導入し、塩ストレス耐性への影響を確認したところ、12番目のグリシンはLEAペプチドの機能に影響を及ぼさないことを確認した。これは、ペプチドのデザイン基となったLEAタンパク質内の配列モチーフにおいて、12番目のグリシンはモチーフ内の任意配列であることからも得られた結果は、それを裏付ける成果となった。また、スプリットインテインを利用して細胞内でLEAペプチドを環状させる研究にも予定を早めて着手し、発現の確認とその機能評価を実施した。
上記のように本年度は網羅的に変異導入により、LEAペプチドの機能に関わる配列と関わらない配列を特定できたこと、またLEAペプチドの環状化への研究にも着手し、発現系を確立したことができたことから、おおむね順調に進展しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
LEAペプチドの物理化学的性質と関連する様々な変数を用いてペプチド配列の主成分分析を行い、3つの主成分に圧縮する。各主成分の寄与率が高いサンプルとストレス耐性試験の結果との相関を評価し、相関係数が高い変数の組み合わせを選抜する。得られた変数が耐性向上に重要な因子の候補となる。
また、定量的構造活性相関解析により、構造情報からペプチド活性値を予測するモデル式を算出する。全ペプチド配列はタンパク質構造計算ツールを利用して構造解析する。構造データとストレス耐性との相関を見出すため、活性値を説明するような線形式、モデルの最適化を行い、ペプチド活性値の予測ができるモデル式を算出する。この解析によりペプチド構造と塩耐性活性との相関を明確にすることで、LEAペプチドが分子シールドとして機能しているのか明らかにする。
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