| 研究課題/領域番号 |
22K05327
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分37020:生物分子化学関連
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
長 由扶子 東北大学, 農学研究科, 助教 (60323086)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
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| キーワード | 代謝回転 / 生合成 / サキシトキシン / in vivo標識 / 長鎖ノンコーディングRNA / ニゲリシン / 生理活性物質 / 麻痺性貝毒 / 渦鞭毛藻 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
麻痺性貝毒は渦鞭毛藻という植物プランクトンの中でもある特定の種が生産する。温暖化などの環境変動に応じた海域の毒性変動予測には渦鞭毛藻細胞内での毒生合成制御に関する理解が必須である。長年の研究で麻痺性貝毒生合成の鍵となる初発の反応を触媒する酵素SxtAの発現制御機構は転写後調節である可能性を見出した。さらに毒生合成には無機窒素を材料として窒素固定を経て生合成される経路と蓄積された成分が再利用されて生合成される経路の２つの経路があるという仮説を提唱した。それらの仮説をもとに、デノボ経路・再利用経路に着目して時空間特異的な渦鞭毛藻の麻痺性貝毒生合成制御における調節因子を探索することを目的としている。
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| 研究実績の概要 |
１．STX生合成におけるデノボ経路及び再利用経路の時空間特異性の解析：代謝回転研究用に最近開発したin vivo標識法を用いて、Alexandrium catenella（Group I)有毒株の15Nの取り込み挙動を観察した。15Nの取り込みプロファイルの変動からデノボ生合成と再利用生合成それぞれの二項分布成分の生産速度を算出し動的に解析する手法を確立した。
２． STX生合成遺伝子をターゲットとするmiRNAの探索：データベース探索したところAlexandrium属の渦鞭毛藻のmiRNAseqデータがすでに登録されていた。有毒無毒で差のあった生合成遺伝子sxtA4の3'非翻訳領域と相同性のある配列を検索したところ複数の配列がヒットした。いずれもmiRNAより長い長鎖ノンコーディングRNAと推測された。それらの配列を基に設計したプライマーを用いてA. catenella（Group I)有毒株のゲノムから重複PCRで増幅産物を得たため、同様な配列の存在が示唆された。
３．代謝阻害剤ニゲリシン添加系の変動解析：アミノ酸輸送活性阻害剤であるニゲリシンを添加した系のSxtA及びRbcLII発現量変動解析とin vivo標識データの動的解析により、ニゲリシンはSTX生合成のデノボ、再利用両生合成を抑制し、代謝を亢進させていると考察した。炭酸固定酵素ルビスコは植物の細胞で最も多くの窒素が分配されるタンパク質であり、その発現が上昇すると窒素含有二次代謝物であるSTX類縁体の生合成が低下し、代謝が亢進することが実験的に初めて明らかとなった。またニゲリシンが前駆体アミノ酸だけでなく、一部の生合成中間体の輸送も抑制しているのではないかという仮説を提唱できた。
遺伝子工学的な手法が適用できない本生物にとって代謝阻害剤とin vivo標識、免疫染色を組み合わせた解析が有用であることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１．STX生合成におけるデノボ及び再利用生合成の時空間特異性を解析するための、動的解析方法が確立できた。本手法は存在量からの解析では解明できない生合成と代謝のバランスを調べることができ、実際に2種の代謝阻害剤の添加系に応用して有用性が検証された。
２．STX生合成遺伝子をターゲットとするmiRNAを探索することを計画していたが、当初予期していなかったsxtA4の３’非翻訳領域に相同定のある長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）が見出された。lncRNAにもmRNAがリボソームでアミノ酸に翻訳されるまでの過程におけるmRNAの安定性を制御することが報告されているため、今後の研究に大いに役立つと考える。なお、別の生合成遺伝子sxtGの3'非翻訳領域についても同様の解析をしたが、相同性のある配列はヒットしなかった。遺伝子によって制御システムが異なる可能性も考えられることがわかった。
３．免疫染色による生合成酵素などの発現解析とin vivo標識による動的解析を組み合わせることで、これまで解析できなかった細胞内の変動が定量的に解析、考察できるようになった。有毒渦鞭毛藻の生長と毒生産のバランスの調節因子を探索する上で必要な情報の取得方法が確立したといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．生合成遺伝子sxtA4の3'非翻訳領域と相同性のあるlncRNAの発現と生合成速度の相関解析：当初はmiRNAseqを計画していたが、lncRNAの可能性がでてきたので計画を変更する。Alexandrium属の渦鞭毛藻有毒株のRNAから今回見出されたlncRNAの発現量をリアルタイムPCRで解析する。同時にin vivo標識データ、生合成酵素SxtA発現量データも取得しそれぞれの変動の相関を解析する。
２．モルフォリノ修飾アンチセンスオリゴの導入実験：１でsxtA4の3'非翻訳領域と相同性のあるlncRNAの発現変動と生合成酵素SxtAのｍRNA及びタンパク質発現量、STX生産速度との相関がみられたら、その配列に対するアンチセンスオリゴを導入して変動が抑制されることを確認する。
３．小麦胚芽セルフリータンパク質合成系による生合成酵素の発現と機能解析：大腸菌で異種発現したSxtGが不溶性タンパク質であり、シャペロンタンパク質と共発現して可溶化しても機能がみられなかったことから、可溶化率の高い小麦胚芽無細胞タンパク質合成システムでの発現により機能解析を試みる。
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