| 研究課題/領域番号 |
22K05388
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38020:応用微生物学関連
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
林 郁子 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 准教授 (80464527)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2024年度: 520千円 (直接経費: 400千円、間接経費: 120千円)
2023年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | 細胞骨格 / 植物 / 微小管 / チューブリン / 病原細菌 / カルシウム / カルモジュリン / タンパク質 / 立体構造解析 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
病原細菌は人・植物に関わらず病原因子（タンパク質）を宿主細胞に注入して病原性を発現させる。宿主に分泌されたタンパク質は宿主内のタンパク質を利用するなどして宿主の生理機能を攪乱する。植物病原細菌Pseudomonas syringaeは多くの植物に病原性を示すモデル的な病原細菌である。その病原因子のひとつHopE1は、宿主のカルシウム情報伝達タンパク質カルモジュリンと微小管結合タンパク質MAP65を介して植物細胞の免疫応答の誘導を阻害するが、その分子機構は明らかになっていない。本課題ではHopE1/CaM/MAP65複合体の立体構造解析を基盤として病原細菌の感染戦略を明らかにすることを目指す。
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| 研究実績の概要 |
植物病原細菌Pseudomonas syringaeは植物に多くの疾病をもたらす代表的な病原細菌として植物免疫研究のモデル生物となっており、Ⅲ型分泌装置と50以上のエフェクター分子をもつ。エフェクター分子のひとつHopE1は宿主のカルシウム結合タンパク質カルモジュリンと協同して微小管束化因子MAP65を微小管から解離させ、最終的には免疫応答の誘導を阻害する。植物細胞において微小管は細胞表層に存在し、MAP65によって束化され安定化されることが広く知られる。しかしHopE1の作用により微小管の配向が変化しないことからHopE1の標的は微小管ではない可能性が考えられる。HopE1の立体構造解析を試みてきたが、これまで立体構造解析に足る量を得ることができていなかった。今年度はHopE1を不溶性画分として大腸菌内で発現させ、巻き戻しを行うことで組換え体タンパク質の調製を試みた。しかし巻き戻しまではうまく行えたものの、純度が高いにも関わらず分解してしまった。これよりHopE1はプロテアーゼの可能性が高いと考え、配列解析とalpha Foldによる構造予測を行った。HopE1の表面にHis残基に隣接したCys残基 が存在するため、このアミノ酸に変異導入し組換え体を得ることができた。これよりHopE1は新規のシステインプロテアーゼと推測できたため、今後はこの変異体を利用してカルモジュリンなどとの相互作用を解析していく。
また今年度は微小管安定性にMAP65とともに影響を与えるSpiral2の構造機能解析を行い、Spiral2の微小管安定化に寄与するドメインとアミノ酸残基を同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
組換え体の取得に手間取り、in vitro解析が遅れているため。しかし現在変異体作成によって目的のタンパク質の調製ができたため、2024年度はタンパク質間相互作用を中心に解析を進めることができる。
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| 今後の研究の推進方策 |
巻き戻しによるHopE1変異体の大量調製を行う。その変異体を用いてカルモジュリン、MAP65との相互作用解析を行う。またHopE1単体の構造解析を行い、分子機能を解析する。
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