| 研究課題/領域番号 |
22K05408
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38020:応用微生物学関連
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| 研究機関 | 香川大学 |
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研究代表者 |
高田 悟郎 香川大学, 農学部, 教授 (50322722)
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| 研究分担者 |
石井 知彦 香川大学, 創造工学部, 教授 (90285718)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
2024年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | 希少二糖 / アロシル糖 / D-アロース / α-アロシル糖 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
希少二糖は希少糖を構成糖に含む二糖である。単糖でも高い生理活性を持つD-アロースを含む希少二糖を創製すれば、未知の生理活性を持つ糖素材が得られる可能性があり、機能性食品や医薬品などの開発研究に大きく貢献できると考えた。本課題は、Rhizobiumu sp.由来の酸化還元酵素を用いた、低コストでD-アロースを発酵生産できる技術の確立を行う。そして、Bacillus sp.由来の糖転移酵素をさらに組み合わせ、新規の3種の希少二糖(D-アロースを含むα-アロシル糖)の生産法を確立し、それらの食品機能性や生理活性を明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
本課題は、トレハロースを出発原料に用い、酸化還元反応による低コストでD-アロースを発酵生産できる技術の確立を行う。また、でんぷんと３種の受容体(D-ガラクトース、D-アルロース、D-タガトース)を出発原料に用い、α-アロシル糖の生産法を確立し、それらの食品機能性や生理活性を明らかにすることが目的に研究を進めている。リゾビウム属S10の変異株を用い、5％トレハロースを含む基本培地１L中で発酵させたところ、3-ケト糖の蓄積がみられた。その後、反応の進行は観察されたが、目標の産物であるD-アロースは検出されなかった。発酵条件の検討および化学的還元法を組合わせる検討を進めている。つづいて、アロシル糖の生産を試みた。市販のα-グルコシル-(1→2)-β-ガラクトシドを酸化還元したところ、α-アロシル糖化合物の生産に成功した。次に、でんぷんとD-ガラクトース・D-アルロース・D-タガトース、L-ソルボースそれぞれにCGTaseを加え、転移二糖の生産を試みた。D-ガラクトースからはグルコシルガラクトース、D-タガトースからはグルコシルタガトース、L-ソルボースからはグルコシルソルボースが生産でき、NMRによりグルコシルタガトースの主産物はα-1，3結合であることが分かった。しかし、グルコシルガラクトースは標品のNMRとは一致せず、複数の結合の混合物であることが示唆された。さらに、還元したところ、グルコシルガラクトースからアロシルガラクトースと思われる生産物が得られた。現在は、グルコシルアルロースの生産、3種類のα-アロシル糖の生産条件の検討を進めるとともに、NMRあるいはX線結晶構造解析による生産物の同定方法を検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
発酵法によるD-アロースの大量生産に主眼を置いて研究を進めている。計画ではリゾビウムS10変異株を用い、トレハロースを含む基本培地１L中で発酵させる。生産物が十分得られない場合は、さらに変異株を得ることや添加物の検討などもを検討している。さらに、D-アロースを含む新規希少二糖(α-アロシル糖)の生産についても実施している。研究は順調に進捗しており、グルコシル糖の生産を行っている。したがって、研究目標の達成に問題はないとみられるため、おおむね順調と評価した。しかし、特に生産物の分離と構造解析(同定)に手間取っており、研究協力者のNMRの専門家や研究分担者のX線結晶構造解析の専門家の支援を受けながら解決策を検討している。
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| 今後の研究の推進方策 |
トレハロース資化性が低くD-アロースを資化しない変異株のリゾビウムS10を用い、5％トレハロースを含む基本培地１L中で発酵を洗浄菌体反応に変更する。引き続き、pH・温度・溶存酸素量の条件を最適化し、添加物(膜透過性を高めるリゾチーム・浸透圧と還元性を高
めるグリセリン、阻害剤の添加など)の条件検討を行う。反応の進行はHPLCで分析し、生産量が十分得られない場合は、遺伝子を導入した組換え大腸菌を用いることも検討する。並行して、酸化還元反応によるα-アロシル糖化合物の生産条件を検討している。でんぷんとD-ガラクトース・D-アルロース・D-タガトース、L-ソルボース、それぞれにCGTaseを加え、転移二糖の最適生産条件をさらに調べる。生産物の分離はせず、アミラーゼで未反応物を分解したのち酵母に消化させ、転移二糖の混合物を得る予定である。さらに、混合物を酸化還元し希少二糖(α-アロシル糖)に変換する。その後、クロマト分離装置で各二糖を分離する。大まかな反応の進行の分析と糖の少量分取は、HPLCで行うことができる。希少二糖の結合位置と構造はNMR、単結晶が得られた糖はX線回折装置で調べる。最後に、嗜好性や栄養性を調べる量の希少二糖を得るのは難しいため、最初は、クロマト分離前の希少二糖液を用い、協力者の支援を得ながらin vitroでの食品機能や生理理活性の有無を調べる。抗酸化活性・腸内細菌増殖活性・α-グルコシダーゼ阻害・リパーゼ阻害・免疫細胞(ナチュラルキラー・キラーT細胞)の活性化・癌細胞(肝癌細胞HuH-7)の増殖抑制などについて、ELISA法や分光法、定量PCR法、FISH-FCM法によって機能性評価を試みる。
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