| 研究課題/領域番号 |
22K05436
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38030:応用生物化学関連
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
荒川 孝俊 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (30523766)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | 酵素 / 活性酸素 / 植物二次代謝 / 活性酸素種 / フラビン / 構造生物学 / 生物無機化学 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
哺乳類など陸生生物体内の主要な解毒酵素であり生合成酵素としても働くB型フラビンモノオキシゲナーゼの酵素触媒機構の仕組みを明らかにする。補酵素フラビンのまわりで起こる酸化還元反応がどのように働くと基質と酸素が結合するのか、またどのように働くと酸素が一方的に還元されて活性酸素を生成する経緯をたどるのか、を調べるための立体構造解析や酵素反応生成物の質的・量的分析や変異体解析などの実験を実施する。種々実験を通して、有用分子生産や生物体内の解毒機構を追究し、また活性酸素生成に対する方策考案へつながる知見獲得を行う。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ニンニクのクラスB型フラビン含有酸素添加酵素（BFMO）であるAsFMO1について生化学・生物生産・構造解析の諸実験を行ってBFMO活性を調節する因子を探し出すこと、触媒サイクルにおける複雑な中間状態を調査することを課題としている。本年度は酵素主反応であるアリイン生成活性、ならびにAsFMO1の活性発揮機序の探索を目的とする以下の実験を行った。
１.アリイン合成を変動させる手段の探索に対しては、基質S-アリルシステインを添加してAsFMO1発現大腸菌を培養した細胞抽出液におけるアリインを調査した。酵素アリイナーゼ添加に応じたアリイン代謝物の検出は極微量であり、細胞内因子によるアリイン生成増強は観測されなかった。加えて、AsFMO1やAsFMO1とヒト肝臓ミクロソームで機能する哺乳類祖先型フラビンモノオキシゲナーゼAncFMO2を精製し、精製酵素に対して反応溶液中の溶存酸素濃度変化を電気化学測定により追跡した。その結果、NADPH添加に応じた酸素消費速度の増減は認められなかった。また、同一条件下でのNADPH消費活性と過酸化水素生成を呈色反応で計測したところ、AncFMO2のNADPH酸化能力はAsFMO1の約半分であり、AsFMO1, AncFMO2がNADPHの還元力を過酸化水素生成に転換する効率は20-25%程度であること、AncFMO2の活性酸素の生成能力はAsFMO1に対して40%程度であることがわかった。
２.AsFMO1の活性発揮機序の探索に対しては、過酸化水素を含有させた反応液のAsFMO1反応時の過酸化水素濃度変化を計測した。生成／消費速度に変化はみられなかったことからAsFMO1はペルオキシダーゼ活性をもたず、過酸化水素を酸素から生成する方向にのみ触媒することが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
設定した4つの小課題のうち生物生産、生化学に基づく小課題１、2の実施を行い結論を得た。小課題2では同系統の哺乳類酵素との比較によりAsFMO1は過酸化水素生成が高く、植物生理において抗酸化の新たな制御点となる可能性が見出された。
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| 今後の研究の推進方策 |
生物生産に基づく小課題1と試験管内反応条件を探索する小課題3と合わせることでアリイン生成能力向上を引き続き図っていく。また当初の計画に従って、結晶構造解析を通して分子機序を調査する小課題4にも着手していく。
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