マメ科の共通物質coumestrolの生合成と生態機能の解析

• 研究課題/領域番号: 22K05457
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分38040:生物有機化学関連
• 研究機関: 日本大学
• 研究代表者: 明石 智義 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (80328707)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
• キーワード: マメ科植物 / ファイトアレキシン / フラボノイド / イソフラボノイド / 生合成

研究開始時の研究の概要

Coumestrolは多くのマメ科植物が蓄積する「共通物質」であり，イソフラボノイドの一種である．これは細胞内では核に存在し，しかもエストロゲンと構造が類似しており，マメ科植物内でシグナル伝達など重要な役割を果たしている可能性が示唆された．
本研究では，ダイズ，ミヤコグサなどを材料とし，coumestrol生合成に関わる未知の酵素遺伝子を同定する．酵素遺伝子が欠損した変異体や，過剰発現または抑制させた組換え植物を用い，遺伝子発現と成分蓄積の関係を対応づけるとともに，形態の変化や微生物に対する応答を検討する．またcoumestrolと相互作用するタンパク質のスクリーニングも試みる．

研究実績の概要

Coumestrolは多くのマメ科植物が蓄積する「共通物質」であり，イソフラボノイドの一種である.この化合物は細胞内では核に存在し，しかもエストロゲンと 構造が類似している.このためcoumestrolは，マメ科植物内でシグナル伝達など重要な役割を果たしている可能性が示唆される. しかしこれまでのところ，生態生理における役割は明らかではない.
本研究ではcoumestrolの生合成機構と関与する酵素遺伝子を明らかにし，遺伝子からのアプローチによりマメ科植物におけるcoumestrolの役割を明らかにす る.
これまでダイズ培養細胞のRNA-seq解析を行い，coumestrol生合成の最後のステップを担う酵素（CS）の候補遺伝子を選抜した．大腸菌発現系を用いてin vitroの酵素アッセイを行い，候補遺伝子のうち1つが，CSであることを確認した．これによりcoumestrol生合成の全容が明らかになった．またカンゾウ，ミヤコグサからオルソログを選抜し、これらも実際に触媒機能を持つことが明らかになった．大腸菌でのCSタンパク質の発現量が低く，発現条件の改良や異なるベクターでの発現を検討した．植物における役割を確認するためダイズ毛状根を用いた，ゲノム編集によるCSのノックアウト体の作成を行うことにした．これまでにゲノム編集用のバイナリーベクターの作成を行った．またダイズの各器官や培養細胞におけるcoumestrolの蓄積を調べた．また各種ストレス処理した植物体での物質の変動の解析を行った．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

目的の酵素遺伝子を取得することができた．今後，組換え酵素を用いた生化学的解析で基質特異性や反応速度などの酵素学的性質を明らかにするため，精製したタンパク質を調製する必要がある．現状では大腸菌での発現量が低い問題があるが，異なるベクターを用いたり，発現条件を検討することにより，改良できると考えている．

今後の研究の推進方策

目的の酵素遺伝子を取得することができたので，今後植物での役割の検討を行う．ゲノム編集・RNAiなどにより遺伝子発現を抑制した組換え植物の作成を試みる予定である．ミヤコグサではLORE1変異体を入手し，ホモ個体の選抜と解析を行う予定である，またcoumestrolの蓄積部位の詳細な解析を行う予定である．