| 研究課題/領域番号 |
22K05502
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38050:食品科学関連
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
前野 覚大 関西医科大学, 医学部, 助教 (70570951)
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| 研究分担者 |
金折 賢二 京都工芸繊維大学, 分子化学系, 准教授 (30273543)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2024年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円)
2023年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2022年度: 2,600千円 (直接経費: 2,000千円、間接経費: 600千円)
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| キーワード | セレウス菌芽胞 / 高圧力殺菌 / 芽胞不活性化 / 高圧NMR / 高圧蛍光顕微鏡 / 高圧顕微鏡 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
高い環境ストレス耐性を示す細菌芽胞は、しばしば重篤な感染症、食品・医薬品製造ラインの汚染を引き起こす。特に病原性細菌の芽胞は、食の安全性を担保するために排除すべき対象であるが、これを微生物学的に制御しながら効率的に不活性化する方法は確立されていない。本研究では高分解能NMRと顕微鏡を用いたバイオイメージングを基軸に、セレウス菌芽胞の物理的ストレス応答における生化学的・形態学的変化の可視化、不活性化を惹起する生化学的・物理的因子の多面的評価を行い、芽胞不活性化の分子基盤解明を目指す。
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| 研究実績の概要 |
本研究は、「病原性菌芽胞の発芽を強く阻害する物理的あるいは生化学的因子を特定し、究極的にはあらゆる菌種に適用可能な万能型芽胞不活性化法を確立する」ことを目的に進めている。「物理的ストレス応答におけるリアルタイムでの生化学的・構造的変化の可視化」を目的として、1年目は病原性セレウス菌の成熟芽胞を使い、外部刺激により不活性化する過程で生じる生化学的変化を調べた（圧力ストレス応答に伴う芽胞漏出成分の検出および解析）。これまでの研究で確立した、高圧NMR法を用いたリアルタイムでの圧力ストレス応答観測法を応用し、セレウス菌芽胞への圧力効果を分子レベルで観察した結果、モデル系である納豆菌芽胞とは異なる内在性プローブ分子DPAの漏出が認められた。そこで2年目は、1年目と同様にNMR法を用いた熱ストレス応答に伴うDPAの挙動変化を調べた。その結果、圧力と熱では芽胞ストレス応答の分子漏出過程における挙動（特に時間スケール）が異なっており、この事実は各環境刺激が作用する箇所あるいはターゲットが違うことを示唆している。また並行して、芽胞からの内在成分漏出過程においてDPA以外のプローブ分子が存在するかを調べたが、現在のところNMRデータベースで同定される新規成分は見つかっていない。続いて、高圧顕微鏡を用いたバイオイメージング法によりストレス刺激に伴い生じる芽胞構造の損傷度を評価した。細胞死をチェックする蛍光プローブ（PI）を使いモデル系での挙動を確認したところ、2000気圧を印加後10分以内に細菌芽胞外殻構造の損傷が起こり、その後の増殖能試験によって高度な不活性化が認められた。また加圧処理後の芽胞外殻構造を電子顕微鏡で観察したところ、本来は扁長楕円体である芽胞体の中心部が大きく凹んでおり、この顕著な外殻構造変化は熱処理後のそれとは明らかに異なっていた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
物理ストレス（圧力/熱）を印加しながら高圧蛍光顕微鏡によるライブイメージングをおこなったが、当初の想定よりも蛍光試薬の発色が悪く、解像度を上げるよう試行錯誤を続けているため十分なデータ量の蓄積ができていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
3年目は、芽胞漏出過程の分子動態を評価するためのプローブ分子の探索およびデータベースを用いた分子同定を行う。また、高圧蛍光顕微鏡を用いたバイオイメージング法と電子顕微鏡観察を組み合わせ芽胞構造損傷度の評価を進め、芽胞内膜構造の損傷が物理刺激後のどの時点で発生するか、特にバルク水侵入との連動性を重点的に検証していく。
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