| 研究課題/領域番号 |
22K05555
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38060:応用分子細胞生物学関連
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
小笠原 慎治 信州大学, 学術研究院理学系, 助教 (50462669)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | RNA編集 / インフルエンザウイルス / RNAポリメラーゼ / キャップスナッチング |
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| 研究開始時の研究の概要 |
DNAを傷つけずに遺伝情報を編集できるRNA編集が遺伝性疾患の治療に有用だと注目を集め始めた。しかし、既存のRNA編集技術は一つの塩基を別の塩基に変換する点編集しかできない。本研究では、インフルエンザウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼを用いて指定した場所以降の配列を自由に書き換える新しいRNA編集技術「RNAオーバーライティング」を開発する。
RNAオーバーライティングは配列の追加・削除、変異の導入・修正などあらゆる編集が可能であり、遺伝子の大幅な欠損や変異が原因で起こる遺伝性疾患を含め、多くの遺伝性疾患の治療に応用できると期待される。
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| 研究実績の概要 |
インフルエンザウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)を利用してmRNAの配列を自由に編集する新しいRNA編集技術「RNAオーバーライティング」を開発することが本研究の目的である。本年度は当初の計画通り以下２つのテーマを行った。
1. RdRpの小型化はどこまで許容されるのか？。 RdRpを構成する３つのサブユニット（PA, PB1, PB2）の内ポリメラーゼの転写反応に直接関与しないPB2の小型化を試みた。PB2のC末端からドメインを１つずつ削除したPB2を発現する６種類のプラスミドを構築した。小型化PB2のプラスミドとその他のサブユニットのプラスミドをHEK293T細胞にコトランスフェクションし小型化リコンビナントRdRdを得た。また、細胞内でのRNAオーバーライティング効率を蛍光レポーターアッセイにより評価した。結果、小型化リコンビナントRdRdを用いたRdRpの活性評価では、N2ドメインまで削除してもRNAオーバーライティングは起った。しかし、細胞内ではどの小型化PB2を用いた場合でも、RNAオーバーライティングはほとんど起こらなかった。
2.テンプレートRNAの配列設計はどこまで自由度があるのか？。テンプレートRNAの末端領域をワイルドタイプの配列からmScarletの配列へ変更し蛍光レポーターアッセイを用いてRNAオーバーライティングの効率を評価した。その結果、配列を置き換えた場合、ワイルドタイプと比較して20％程度の効率に落ち込んだ。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
予期せぬ大きな問題もなく当初の計画通りに進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
概ね当初の予定通り進める。2023年度に開始したテンプレートRNAの配列設計はどこまで自由度があるのか？を引き続き行い、より詳細に調べる。加えて、アクチンのmRNAを標的にした内在mRNAのRNAオーバーライティングを試みる。
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