| 研究課題/領域番号 |
22K05557
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38060:応用分子細胞生物学関連
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
杉本 美海 (橋本美海) 名古屋大学, 生命農学研究科, 講師 (70437755)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | プラスチド / オルガネラターゲティング / アグロバクテリウム / サイトカイニン合成酵素 / トランジットペプチド / TOC/TIC複合体 / プラスチド（色素体） / 細胞内輸送 / サイトカイニン / 病原菌 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
植物病原菌アグロバクテリウムは植物に感染し、腫瘍を形成する。この菌はサイトカイニン（CK）合成遺伝子tmrを持っており、この遺伝子を植物ゲノムに組み込む。発現したTmrタンパク質は色素体に運ばれると植物が生産するCK合成経路上の基質を奪い、高活性化型のCKを生産することで細胞分裂が異常となり腫瘍化を引き起こす。通常核ゲノムコードの色素体タンパク質にはトランジットペプチド（TP）という色素体移行シグナル配列が存在するが、Tmrには存在しない。つまりTmrの色素体移行は病原菌が独自に発達させたメカニズムなのかもしれない。本研究はTmrの宿主細胞内相互作用因子を単離することでこの機構の解明を目指す。
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| 研究実績の概要 |
植物病原菌アグロバクテリウムは植物へ感染すると感染部位に腫瘍を形成する。植物ホルモンであるサイトカイニン（CK）は細胞内の色素体で作られ、植物の細胞分裂に関わるが、アグロバクテリウム自身もCKの合成遺伝子(tmr）を持ち、感染時にこの遺伝子を植物の核ゲノムに組み込む。tmrは植物細胞内で転写翻訳され色素体へと運ばれ、正常なホルモン生産を阻害し、過剰なCK合成を引き起こすことで腫瘍の形成を促進させる。通常色素体に移行するタンパク質は色素体移行シグナルであるトランジットペプチド（TP）を持ち、色素体包膜のTOCに認識され、TOC/TIC複合体を通って色素体内に移行する。しかし、Tmrには典型的なTPが存在しない。Tmrの色素体移行のメカニズムの解明は病原体の戦略の理解とこれを応用した植物防除の観点からも重要であると考え、Tmrがどのようにして色素体に移行するのかを調べた。
これまで免疫沈降法によりTmrの相互作用因子として、TPを持つタンパク質が色素体へ移行するのを助けるシャペロンタンパク質が複数検出されたが、TOC/TIC複合体はあまり検出されなかった。このため、TmrもTOC/TIC経路を通るのか不明であった。免疫沈降法ではTOC/TICのような膜に埋め込まれたタンパク質の検出は難しく、可溶化するための処理が強いとTmrと結合するタンパク質との相互作用を弱めてしまう可能性が考えられたため、強い可溶化の条件でも検出可能な近接標識法による解析を行った。その結果、TOC/TIC複合体の中でも特にTPの認識に働くTOC159が検出された。さらに、色素体内に入ったタンパク質のTPを切断するSPPなどが検出されたことからも、Tmrは典型的なTPを持たないにもかかわらず、TPをもつタンパク質と同様の経路を通ると推定された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまで免疫沈降法によるTmrの相互作用因子の同定結果から、Tmrも典型的なTPを持つタンパク質と同様な経路を通るのではないかと予想された。そして今回の近接標識法でTmrのごく近傍にTOC/TIC複合体とその周辺に存在する因子が多数存在することが明らかとなった。典型的なTPであるルビスコ小サブユニットのssuTPの相互作用因子と比較したところ類似性が非常に高いことがわかり、この予想は強く支持された。つまり、病原菌由来のTmrは明確なTPを持たないにもかかわらず、植物細胞内で一般的な葉緑体タンパクが運ばれる経路を利用していることが明らかになった。
その一方でssuTPとは相互作用しないが、Tmrとは相互作用する因子Xを発見した。病原菌による腫瘍の形成にはCKと細胞の伸長を担う植物ホルモンであるオーキシン(IAA)の両方が必要であるが、XはIAAの機能に影響を与えることが知られている。TmrはCKを合成する酵素であるが、この働きのほかに、Tmrとの直接的な相互作用によってIAAの機能にも影響を与える可能性があるのかもしれない。腫瘍形成にはIAAとCK両方が過剰に生産される必要があるが、古くからお互いのホルモンは拮抗的に作用することが知られている。病原菌由来のCKの合成酵素TmrがIAAの活性を持続させることにも貢献しているという可能性は病原菌の戦略として理にかなっており、これを今後明らかにしていくことによって病原菌が効率よく腫瘍を形成できる理由を説明できるかもしれない。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の方針として、まずはTmrがTOC/TIC複合体を通過して色素体に入ることを示すために、toc159変異体においてTmrが色素体内に入ることができないことを検証したい。具体的にはtoc159機能欠損変異体におけるTmr-GFPの局在を調べる予定である。toc159変異体は個体が小さく、地上部が白化することも多い。このため葉での検証が難しい可能性もあるので地上部だけでなく根におけるプラスチドの観察も行う。また、toc159だけでなく、プラスチドへの移行に関わるシャペロンの機能欠損変異体を用いて同様の実験を行う。
TmrのIAAに対する影響を調べるために、植物においてTmrを過剰発現させたときのIAA, CKなどのホルモン含量の測定、RT-PCRおよびPromoter:GUSアッセイによるIAA, CK応答遺伝子の発現を解析する。また、Tmr単独で腫瘍を形成できるのかを調べるためにTmrを部分的に過剰発現させその部位に腫瘍形成がされるのかを調べる。さらにどのくらい腫瘍形成をしやすくなるのかを検証するために、Tmr過剰発現体においてオーキシン、サイトカイニンの濃度を段階的に培地上でのカルス形成能を調べる予定である。
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