| 研究課題/領域番号 |
22K05819
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分40040:水圏生命科学関連
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| 研究機関 | 三重大学 |
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研究代表者 |
一色 正 三重大学, 生物資源学研究科, 教授 (30378319)
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| 研究分担者 |
末武 弘章 福井県立大学, 海洋生物資源学部, 教授 (00334326)
瀧澤 文雄 福井県立大学, 海洋生物資源学部, 准教授 (60822913)
仲山 慶 愛媛大学, 沿岸環境科学研究センター, 講師 (80380286)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2024年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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| キーワード | 口白症 / ウイルス / トラフグ / KAR / ワクチン |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では， 口白症感染魚に特異的に発現する３つのRNA分節（Kuchijirosho-Associated RNA：KAR）を糸口に口白症ウイルスの感染環およびゲノムの全容を解明し，口白症の防除法確立を目指す。すなわち，（１）KAR遺伝子とKARタンパク質の検出による口白症ウイルス感染機序の解析および抗KARタンパク質抗体などを用いて効率的に分離・濃縮・精製したウイルスの詳細なゲノム解析を行い，これらの情報を基に（２）KARを利用したリコンビナントワクチンおよびDNAワクチンの開発を行う。
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| 研究実績の概要 |
口白症感染魚に特異的に発現する３つのRNA分節（Kuchijirosho-Associated RNA：KAR）について，1）KARのリコンビナントタンパク質の作製，および2）KARを利用したDNAワクチンの開発に関する研究を行った。具体的には以下のとおりである。
1）各KAR- A,-B ,-CのcDNA断片をN末端にHisタグを付与する発現ベクターpET-22b(+)へ組み込み，4種類の大腸菌Escherichia coli株（BL21 DE3, BL21 DE3 pLysS, Rosetta gamiB, Rosetta gamiB DE3 pLysS）に導入し，リコンビナントタンパク質を合成した。その結果，発現プラスミドに導入されたKARsに由来するタンパク質（分子量：約50 kDa）が発現し，KAR-A,-B, -C の発現量にはE. coli 株による差異が確認された。また，ウエスタンブロッティングにより，抗Hisタグ抗体との抗原抗体反応が確認されたため，得られたタンパク質はKARに由来すると考えられた。今後は，このリコンビナントタンパク質をウサギに免疫して抗体を得る。
2）KAR- A,-B ,-Cをそれぞれ組込んだ真核細胞発現プラスミドベクターをフグに筋肉注射後，DNAワクチンとしての効果を検証した。その結果，KAR-Aプラスミド区において，攻撃試験における死亡率が有意に低く，かつ生残魚の口白症の症状が他の試験区と比べて軽微であったが，全ての試験区の生残魚の脳からKARが検出され、その発現量は各区間で有意差がなかった。これらの結果から，KAR-Aプラスミドを接種したトラフグでは，口白症の重篤化を予防する効果が誘導されたと推察された。今後は，接種原をKAR-Aプラスミドに絞り，そのワクチン効果を詳細に検証する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究実施計画項目のうち，１）抗KARタンパク質抗体の作製，２） KAR遺伝子およびKARタンパク質の検出による口白症ウイルスの感染機序の解析において，抗原として必要であるリコンビナントタンパク質が作製できたこと，ならびに４）KARのワクチン抗原としての可能性を検証するワクチンうち，DNAワクチンとしての効果が検証できたことから，令和5年度以降もほぼ当初計画どおりに実験を遂行することができる。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）～４）の研究を総合的に推進する。
１）抗KARタンパク質抗体の作成：２）および３）においてKARタンパク質の性状解析および精製を行うための抗体を作製するために，合成したKARのリコンビナントタンパク質をウサギに免疫して抗体を得る。
２） KAR遺伝子およびKARタンパク質の検出による口白症ウイルスの感染機序の解析：KAR遺伝子に対するRNAプローブを用いたin situハイブリダイゼーションを用いてKARの組織分布の変化を経時的に追跡し，感染経路を解析する。さらに，抗体を用いた免疫組織染色法を併用し，KARタンパク質の発現・局在を確認する。
３）口白症ウイルスのゲノム配列の決定：様々な方法を用いて効率的に精製ウイルスを採取し，口白症ウイルスの全ゲノム配列を明らかにする。
４）KARタンパク質のワクチン抗原としての可能性：KARあるいはウイルスの構造タンパク質や非構造タンパク質遺伝子，およびそれらのリコンビナントタンパク質がワクチン抗原となりうるかを類推する。
さらに，１）～４）の研究について，得られた結果を取りまとめ，成果の発表を行う。
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