| 研究課題/領域番号 |
22K05820
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分40040:水圏生命科学関連
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
久保田 賢 高知大学, 教育研究部総合科学系黒潮圏科学部門, 教授 (00314980)
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| 研究分担者 |
目崎 拓真 公益財団法人黒潮生物研究所, 研究部局, 研究所長 (20840482)
田口 尚弘 高知学園大学, 健康科学部, 教授 (80127943)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
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| キーワード | マイクロサテライト / 網状進化 / ミドリイシ属サンゴ / FISH分析 / 染色体 / FISH / マイクロサテライト配列 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ミドリイシ属サンゴでは，様々な組み合わせの種間交雑が観察されており，網状進化の可能性が指摘されてきた。最近，胚の交配実験による網状進化の初期現象となる戻し交雑や5種のミドリイシ属サンゴの全ゲノム解析による浸透的交雑が報告され，長年の予測どおり網状進化はミドリイシ属サンゴの進化にとって一般的な現象である可能性が高まった。本研究では，その証明に有効と考えられる染色体解析用のプローブの開発を目指す。
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| 研究実績の概要 |
2022年度は，夏季のミドリイシ属サンゴの産卵時期（例年7月～9月の下弦前後）の天候不順により，クシハダミドリイシ等の一部の種については試料収集が可能であったものの，交雑実験の実施のために十分な試料を得ることはできなかった。
マイクロサテライト領域のFISH（蛍光in situハイブリダイゼーション）分析用プローブの開発について，上記のとおり胚試料が採取できたこと，全ゲノム配列情報が公的データベースに登録されていることなどから，クシハダミドリイシに焦点を絞り，”Tandem Repeats Finder”プログラムを用いて，繰り返し配列の網羅的分析を実施して繰り返し配列のリストを作成した。その結果，全205種の繰り返し配列が検出された。コピー数については，そのうち187種の配列について，500以下であることが分かったが，1500～2000コピー存在するものも2種存在した。また，繰り返し配列長については，500 bp長まで万遍なく分布していた。
FISH分析では一般的に，1,000 bp以下のサイズのプローブではたとえゲノムDNAとの配列の類似性が高くてもシグナルが弱く，対象物の検出が困難である。そこで，FISHプローブ開発の候補として，繰り返し数と繰り返し配列長の積を計算し，その分布を確認した。その結果，10,000～15,000 bpのサイズのものが118種，15,000～20,000 bpのものが44種，20,000～25,000 bpのものが23種と，FISHプローブとしては十分な長さを有していることが判明した。
ここで得られた配列については，繰り返し配列の外側の配列（繰り返しでない）が判明しているため，その部分でPCRプライマーを設計し，FISHプローブを作成するとともに，繰り返し配列部分について，約30 bpの合成ヌクレオチドに蛍光標識をしたものも作成してFISH分析を行なった。しかしながら，どのプローブについてもシグナルを検出することができなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
天候不順により，網状進化の検証に必要な種間交雑胚の取得に必要な，産卵個体（バンドル）の採取が困難であったことが挙げられる。
繰り返し配列がFISHプローブとして機能しなかった件について，ポジティブコントロールに当たる実験では，十分なシグナルが観察されていることから，採取した群体の種（クシハダミドリイシ）がゲノム配列の公的データベースに登録されている同種（Acropora hyacinthus）と生物学上異なる可能性が高いと考えた。この問題については，独自に全ゲノム配列を解析すること，そのデータセットを用い，改めて繰り返し配列の検索を行なうことが根本的解決法であると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
交雑胚が得られなかったことについて，主な原因が天候の問題であったため2023年度も同様な問題に直面する可能性もある。そのような場合については，過去に採取したバンドルを使って交雑させ，染色体分析に適切なステージまで発生させて固定した保存試料での分析が可能かどうかを検討する。
FISHプローブの開発において，対象としている種の群体から全ゲノムDNAを生成し，ゲノム配列を分析することが根本的解決法ではあるものの，当初の研究計画に含まれておらず，本助成では費用を捻出することが困難である。そこで，他のミドリイシ属サンゴのゲノムDNAの配列解析結果と共通性の高い繰り返し配列を探し，それをプローブとして用いるなどの方法を検討する予定である。
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