| 研究課題/領域番号 |
22K05828
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分40040:水圏生命科学関連
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| 研究機関 | 国立研究開発法人水産研究・教育機構 |
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研究代表者 |
河邉 真也 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産大学校, 講師 (60579415)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2025年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
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| キーワード | リポキシゲナーゼ / cDNAクローニング / LOX / 魚臭 / 短鎖オキシリピン |
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| 研究開始時の研究の概要 |
魚臭さは若年層の魚食離れの一因とも言われており、近年では果実等を加えた飼料で養殖して香り付けをした魚も開発されるようになってきた。しかし、鮮魚臭の生合成、即ち不飽和脂肪酸の酸化とそれに続くアルコール類やアルデヒド類（鮮魚の魚臭さを出す）の生合成の詳細は不明であり、魚臭さの根本的な除去は今も困難である。
本研究では、海産魚類において不飽和脂肪酸の酸化還元酵素リポキシゲナーゼの遺伝子クローニングと発現解析をするとともに、酵素の機能解析を実施する。加えて、各種リポキシゲナーゼの発現様式を魚臭生合成の指標として応用することを目指す。
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| 研究実績の概要 |
魚類のリポキシゲナーゼ（LOX）遺伝子の遺伝子情報を得るために、cDNAクローニングに取り組んだ。また、魚類遺伝子発現解析の基盤を構築するために、内部標準遺伝子に用いる伸長因子（EF-1α）のcDNAクローニングを試みた。海産魚類の鰓からRNAを抽出し、逆転写反応を経て一本鎖cDNAを合成した。LOX用の縮重プライマーは、哺乳類LOXの一次構造と一部の魚類ゲノム情報を基に、種を超えて保存されているアミノ酸配列を得て設計した。EF-1α用の縮重プライマーは、哺乳類から酵母まで保存されている一次構造から設計した。RT-PCR法により、ウマヅラハギとマサバの鰓から、哺乳類の12S-LOXに相同性を持つcDNA断片とEF-1αのcDNA断片を得ることに成功した。PROSITEを用いたモチーフ検索を行ったところ、魚類LOXの断片配列は、アミノ酸配列の全体にわたってLIPOXYGENASE_3（リポキシゲナーゼ鉄結合型触媒ドメイン）が認められ、LOXの酵素活性に必須な非ヘム鉄の結合に重要である3つのヒスチジン残基が保存されていることが分かった。次に転写開始点を含む完全長cDNA配列を得るために、cDNA断片配列から遺伝子特異的プライマーを設計し、5’-および3’-RACEによる完全長cDNAクローニングを試みた。転写開始点の決定には、oligo-capping法を採用した。全RNAのCIPとTAP処理とそれに続くT4 RNA ligaseによる合成オリゴの導入後、逆転写反応に供することで5’-キャップ構造を持つ完全長mRNAのみからRACE-ready cDNAを構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新型コロナウイルス感染症の影響により、十分な感染防止対策を講じる必要性が生じ、作業時間の短縮を余儀なくされた。RACE-PCRまで進める予定であったが、RACE-ready cDNAの構築に留まったため、進捗状況はやや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2023年度は、構築したRACE-ready cDNAを用いてRACE-PCRを実施し、完全長cDNA配列の取得を試みる。転写開始点を同定した後は、ゲノムウォーキング法により転写開始点より上流のゲノムDNA領域の解析を実施し、プロモーター領域の情報を得る。また、LOX酵素の機能解析を行うために、無細胞系の翻訳システムの構築に取り組む。
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