| 研究課題/領域番号 |
22K05939
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分41050:環境農学関連
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
堀内 正隆 北海道医療大学, 薬学部, 准教授 (90322825)
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| 研究分担者 |
永田 崇 京都大学, エネルギー理工学研究所, 准教授 (10415250)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2025年度: 390千円 (直接経費: 300千円、間接経費: 90千円)
2024年度: 260千円 (直接経費: 200千円、間接経費: 60千円)
2023年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円)
2022年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
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| キーワード | ハイブリッド酵素 / セルラーゼ / セルロース / 好冷菌 / タンパク質工学 / グルコース生産 / 結晶性セルロース |
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| 研究開始時の研究の概要 |
エタノールは、持続可能性をもつ代替燃料として注目されており、その原料となるグルコースを、バイオマスから低コストで生産するシステムの開発が急がれている。北海道などの低温地域は、豊富なバイオマス資源を有するが、既存の高温型酵素を利用したグルコース生産法では、加温コストが事業化の障壁となることから、低温地域に最適化された低温型グルコース生産技術が必要である。本研究では、氷温でバイオマスを分解することのできる好冷菌型ハイブリッドセルラーゼを開発し、低温地域に最適化された革新的グルコース生産システムを創成する。
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| 研究実績の概要 |
令和4年度は、低温型ハイブリッドセルラーゼの酵素ユニットのうち、Sclerotinia borealisの溶解性多糖モノオキシゲナーゼ (sbLPMO) について、大腸菌、Pichia pastorisおよびBrevibacillusを宿主とした発現を試みた。S. borealisには3種類のLPMO候補遺伝子が存在していたため、それらをすべて発現ベクターにクローニングした。大腸菌では、組換えタンパク質はすべて不溶性画分として得られたことから、複数の条件下での可溶化やリフォールディングを試みたが、活性のある可溶化酵素は得られなかった。Pichia pastorisにおいては、そもそも目的タンパク質の発現を確認できなかった。これらに対し、Brevibacillusでは、2種類のsbLPMO遺伝子について、培地画分に組換えタンパク質が確認された。
発現したsbLPMOは、C末端側に付加したHis-tagを利用して、Niキレートカラムによるアフィニティー精製した。過酸化水素の存在下で、得られたsbLPMOのうちの1種類について2,6-ジメトキシフェノールの分解活性を調べたところ、pH 8のときに最大の活性を示すことが明らかとなった。
その他に、新規の酵素ユニットとして、S. borealisのセロビオースデヒドロゲナーゼ (sbCDH) のクローニングを行った。ただし、sbCDHの塩基配列は、データベース上のゲノムベースの配列とは異なる部分が複数存在することから、現在、他の種のCDHとの配列比較を行い、sbCDHの塩基配列の妥当性について検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ハイブリッド酵素の酵素ユニットの個別生産のうち、当初2年間に実現すべき2種類のうち、1種類目の生産に成功したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、ハイブリッド酵素の酵素ユニットの個別生産のうち、当初2年間に実現すべき2種類目の生産を実現し、それぞれの酵素活性を測定する。活性が確認できた酵素ユニット同士を、遺伝子工学的あるいはタンパク質化学的に接続したハイブリッド酵素を作製する。
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