| 研究課題/領域番号 |
22K05979
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分42020:獣医学関連
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
杉 達紀 北海道大学, 人獣共通感染症国際共同研究所, 助教 (90745944)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2024年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
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| キーワード | トキソプラズマ原虫 / DUAL-Transcriptome / 免疫応答攪乱因子 / プロモーター / トキソプラズマ症 / 潜伏感染 / 宿主寄生体相関 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
トキソプラズマ原虫は潜伏感染期において宿主免疫を回避しているが、その分子機序は不明である。本研究では、潜伏感染期特異的な宿主細胞制御を行えない組換え原虫を作出して、潜伏感染特異的な宿主細胞制御が原虫の宿主免疫回避能力に果たす役割を明らかにする。本研究によってトキソプラズマの感染ステージごとの宿主細胞制御による感染ニッチ形成の仕組みが解明され、「宿主の免疫系を活用して潜伏感染原虫を排除する」これまでにない対策手法への道筋が開かれる。
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| 研究実績の概要 |
トキソプラズマ原虫は潜伏感染期において宿主免疫を回避しているが、その分子機序は不明である。本研究では、潜伏感染期特異的な宿主細胞制御を行えない組換え原虫を作出して、潜伏感染特異的な宿主細胞制御が原虫の宿主免疫回避能力に果たす役割を明らかにすることを目的としている。
本年度は、急性感染期と潜伏感染期で異なる強さで宿主を制御している原虫の免疫活性化因子および抑制因子の絞り込みを完了した。候補因子の一つであるGRA15は潜伏期においては発現の減少が認められる免疫系活性化因子であり、潜伏期においても急性期と同等の発現を維持できれば潜伏期における宿主細胞免疫系の抑制を崩せると着想した。急性期における野生型GRA15の発現量と同等の遺伝子発現を急性期、潜伏期の両方のステージで実現可能なプロモーターをトランスクリプトーム解析から選定し、野生型のGRA15のプロモーターを該当プロモーターに置き換えた組換え原虫を作出した。組換え原虫のGRA15発現量が野生型原虫と比較して急性感染期において同等程度であり、潜伏感染においては野生型より増加していることを確認した。
一方、潜伏期において宿主制御が観察されている免疫抑制因子の宿主細胞への移行を司るMYR1については潜伏感染期のみで発現を減少させるプロモーターへの置き換えを試みたが、適切な発現量を実現するプロモーターが発見できていない。
そこで、プロモーターの強度を自在に操る手法を別途開発すべく、トキソプラズマのコアプロモーター領域の配列モチーフの解析を進めた。既報で報告されているコアプロモーター因子の一つであるチミジンリピート領域が原虫の感染期によらず保存されていることを発見し、ステージ特異的な発現量調整とは独立してプロモーター強度を操作できうる配列候補として同定された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
【①潜伏感染期特異的な宿主細胞制御を行えない組換え原虫を作出】GRA15を潜伏感染期においても適切な量で発現する組換え原虫の作出に成功し、計画目標としていた潜伏感染期においての宿主細胞制御が変化した原虫を得ており、計画通りに進んでいる。一方、バックアップとして用意を進めていた潜伏感染期のみで発現量が低下するMYR1を保有する組換え原虫については急性期において野生型と同等の発現量を保有しながら感染期特異的に発現量を変動させるプロモーターの同定に至っておらず、プロモーターの強度を操作する手法の開発が必要なことが課題として明らかになった。
【②バルクRNAseqによる低コストで潜伏感染期における宿主細胞応答を解析する手法の確立】シングルセルトランスクリプトームのデータを追加検証し、潜伏感染期特異的なマーカー遺伝子ＬＤＨ２の強度に応じた細胞のより分けのみで潜伏感染期の宿主細胞を選択できることが示唆された。LDH2のプロモーターでGFPを発現する原虫を用いて検証実験を実施し、潜伏感染期虫体が細胞内に寄生している状態の宿主細胞をFACSで分離する条件を確立した。
【③人工プロモーターによる遺伝子発現量操作手法の開発】①において問題となった適切な遺伝子発現強度のプロモーターが得られない課題について、既知の感染期特異的プロモーターの強度を改変した人工プロモーターを作出することを着想した。すでに感染期によらずに保存されているコアプロモーター因子を発見しており、遺伝子発現強度を調節する配列モチーフの候補同定に成功している。
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| 今後の研究の推進方策 |
R4年度に得られた組換え原虫を用いて潜伏感染期における宿主細胞制御の詳細の性状解析を進める。具体的には潜伏感染期の虫体が感染している宿主細胞をFACSで分取したのちのRNAseqを用いたトランスクリプトーム解析および、既知の宿主応答であるNF-kBシグナルの変動の観察、in vivoにおける潜伏感染時の動態を観察する予定である。
R4年度に得られた感染期によらないコアプロモーター因子配列に無作為変異を加えた人工プロモーター配列群を調整し、プロモーター強度を評価することで、適切な発現量を実現する人工プロモーターライブラリの確立を目指す。このライブラリを活用することで、R4年度に作出ができなかったMYR1遺伝子を潜伏感染期特異的に発現減少する組換え原虫を作出する。また、人工プロモーターライブラリにより、幅広い発現量の原虫因子について感染期特異的な遺伝子発現の攪乱をすることが可能となることから、GRA15,Myr1以外の宿主細胞の免疫応答に影響を与える原虫因子についても感染期特異的な遺伝子発現制御を攪乱した原虫を作出し、潜伏感染特異的な宿主細胞制御を欠いた組換え原虫、ひいては、潜伏感染期における宿主免疫回避能を欠いた原虫を作出することを目指す。
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