| 研究課題/領域番号 |
22K05985
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分42020:獣医学関連
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
平田 暁大 岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (30397327)
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| 研究分担者 |
宮脇 慎吾 岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (70756759)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 遺伝性消化管ポリポーシス / ジャックラッセルテリア / 家族性大腸腺腫症 / 消化管腫瘍 / 遺伝性疾患 / ゲノム編集 / マウス / Autopsy imaging / 修飾遺伝子 / イヌ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
研究代表者は、消化管に腫瘍を引き起こすイヌの新規の遺伝性疾患を同定した。本疾患の症例データの蓄積が進むにつれて、疾患の重症度（腫瘍の発生数、発症年齢）には大きな個体差があり、また、腫瘍が悪性化して死亡する症例もいることがわかってきた。そこで、本研究では、本疾患の重症化に関わる先天的な因子（重症化する症例が有する遺伝子多型）と後天的な因子（悪性化した腫瘍に生じた遺伝子異常）を明らかにし、そのメカニズムを包括的に解明する。本疾患と類似の遺伝性疾患は人にも存在し、本研究は人の疾患の理解にもつながる。
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| 研究実績の概要 |
家族性大腸腺腫症（Familial Adenomatous Polyposis, FAP）はAPC遺伝子の生殖細胞系列変異を原因とする常染色体顕性遺伝性疾患であり、大腸における腺腫性ポリープの発生を特徴とする。近年、我々は、ジャックラッセルテリアにおいて、ヒトのFAPに類似する新規の遺伝性疾患である「遺伝性消化管ポリポーシス」を同定した。遺伝性消化管ポリポーシスの罹患犬は同一のAPC遺伝子変異（c.[462_463delinsTT]）を有しており、消化管において腫瘍性ポリープ（腺腫、腺癌）の発生がみられる。イヌの散発性の消化管腫瘍は転移率が高く、予後が悪い腫瘍である。一方、本遺伝性疾患で生じる消化管腫瘍は転移することはまれで、予後が良いことが分かっているが、散発性腫瘍の症例と同様に、腫瘍が全身転移して死亡する場合もある。
そこで、腫瘍の悪性化のメカニズムを解析するため、本遺伝性疾患の罹患犬の小腸腺癌の肝臓、肺、リンパ節転移巣を採取し、継代培養して3種類の細胞株を樹立した。各細胞株からDNAを抽出し、PCRダイレクトシーケンス法によりAPC遺伝子の生殖細胞系列変異および体細胞変異を解析し、全ての細胞株において、ヘテロ接合型の生殖細胞系列変異（c.[462_463delinsTT]）に加えて、同一のフレームシフト変異（c.[509_512delATAG]）が認められ、さらに、TAクローニングにより同変異は野生型アレルに生じていることを確認した。原発腫瘍は、発がんの2ヒット説に従い、野生型アレルに体細胞変異が加わることにより発生したことが示唆された。一方、細胞株には、ヒトの大腸腫瘍の悪性進展過程でみられる、p53、K-ras、BRAFなどの遺伝子変異は認められず、異なる機序で悪性化したことが示唆された。現在、その解明のため、細胞株の全ゲノムシーケンス解析を実施している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ジャックラッセルテリアの「遺伝性消化管腫瘍性ポリポーシス」は近年発見された遺伝子性疾患であり、当初は予後の良い疾患と考えられていた。しかし、症例データの蓄積が進むにつれて、疾患の重症度（腫瘍の発生数、発症年齢）には大きな個体差があり、また、腫瘍が悪性化して死亡する症例もいることもわかってきた。本研究では、本疾患の重症化に関わる“先天的な” 因子（疾患の重症度に影響する遺伝的修飾因子）と“後天的な” 因子（腫瘍に生じた悪性化に関わる遺伝子異常）を同定し、その分子メカニズムを包括的に解明する。
先天的な因子の検索では、重症度の異なる症例の比較から遺伝的修飾因子（遺伝子多型）の候補を同定し、モデルマウスで検証する。昨年度までに、イヌと同じApc遺伝子変異を有するゲノム編集マウス（ApcΔ155マウス）を作製し、イヌと類似の病態を再現できることを確認した。また、本疾患の症例の多数のDNA検体を保持しており、遺伝的修飾因子の検索の準備を終えている。
後天的な因子の検索では、主に悪性化した腫瘍に生じた体細胞変異の解析を実施する。これまでに、消化管腫瘍の転移により死亡した5頭の病理解剖を行い、その病態を詳細に把握するとともに、リンパ節、肺や肝臓などの遠隔臓器の転移巣から細胞株の樹立に成功した。現在、樹立した細胞株を用いて、腫瘍の悪性化に関わる遺伝子異常の検索を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では、ジャックラッセルテリアの「遺伝性消化管腫瘍性ポリポーシス」の重症化に関わる“先天的な” 因子（疾患の重症度に影響する遺伝的修飾因子）と“後天的な” 因子（腫瘍に生じた悪性化に関わる遺伝子異常）を同定する。
先天的な因子の検索については、来年度は、重症度の異なる症例の比較から遺伝的修飾因子（遺伝子多型、SNP）の候補の検索を行う。全ゲノムシーケンスにより、重症例と軽症例のDNA配列を網羅的に解析し、両者で異なるSNPを検索する。我々は、本疾患の罹患犬の検体のDNA検体を多数保持しており、これらの検体を利用して、候補となったSNPと病態の重症度の関連について検証し、候補の絞り込みを行う。最終的に候補となった数個のSNPを有するマウスをゲノム編集によって作製し、ApcΔ155マウスと交配し、SNPの導入により消化管腫瘍の発生数が変化するかを検証する。また、Apc(Min/+)マウスなどのApc遺伝子変異を有する既存のFAPのモデルマウスでは大腸に微小病変が生じることが知られている。ApcΔ155マウスにも同様の病変を検出できれば、その定量的な評価によってより正確に腫瘍発生へのSNPの影響が評価できる可能性があり、ApcΔ155マウスの病態・表現型についてもさらに解析を進める。
後天的な因子の検索では、サンプル量の制限の少ない細胞株を用いて、全ゲノムシーケンスにより体細胞変異の解析を実施する。さらに、得られた結果は、これまでに収集した悪性度の異なるイヌの腫瘍検体を用いて検証する。
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