| 研究課題/領域番号 |
22K06080
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43010:分子生物学関連
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
北畠 真 京都大学, 医生物学研究所, 助教 (10321754)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | リボソーム / 品質管理 / ユビキチン |
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| 研究開始時の研究の概要 |
リボソームの品質管理に関わる鍵となる因子に相互作用するタンパク質をすべて網羅的に解明していく予定である。
得られた候補因子については、鍵因子との相互作用の解析や、異常リボソームのユビキチン化への関与など、生化学的な解析を進めたい。リコンビナントタンパク質の調製を試みるが、良質なリコンビナントが得られた場合にはリボソームとの複合体を作成して構造解析にも挑戦し、異常リボソームが認識される仕組みを明らかにしていく予定である。
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| 研究実績の概要 |
Plg1はそのC末端をリボソーム表面に密に結合していることがすでに分かっている。E3リガーゼとの結合にはN末端が関わっていることも、すでにわれわれの研究から明らかになっている。このN末端にBioID（または改良版のTurboID）を融合してビオチンを添加し、Plg1のN末端に近接するタンパク質を網羅的に解明するのが第一の目標である。本年度は各種のN末BioIDを作成して調査を行った。基本的にはN末にBioIDを融合したPlg1もリボソームへの結合は阻害されないようであった。このことはC末端によりリボソームに結合するというこれまでの知見とよく合致していた。しかし一方で、BioIDを含んだPlg1の遺伝子でゲノム上の野生型Plg1を置き換えたところ、機能不全25S rRNA変異体の分解に大きな遅延が見られることが明らかになった。N末端はE3リガーゼ複合体との間に相互作用を行う重要なドメインであるため、ある程度の大きさのあるBioIDタグをここに融合することで、肝心のE3リガーゼ複合体との相互作用が阻害されているようである。本研究の目的はE3リガーゼにより認識される瞬間の機能不全リボソームの構成要素を明らかにすることであり、このままでは使用に適していないことが明らかである。BioID以外に同様の目的で（しかし異なる原理で）使われるAPEX法についても並行で準備を進めており、こちらの方が影響が少なければ実験を先行させていくことも検討している。どちらもE3リガーゼの結合に阻害的に働く場合には、ともかくE3結合前の機能不全リボソームの姿を解明することを優先し、E3が結合しなくとも他の近傍に存在する因子の網羅的解明を進めていこうと考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2022年度の後半にあったライフイベントにより研究の進捗が大幅に制約された。また本研究と関連した知財関連の申請手続きがあり、そちらの準備にも大きな時間が必要であった。結果として、2022年度前半に進めた実験準備では進捗があったものの、それらを使った目的の実験までには到達できていない。また、実験の大きな柱であったBioID法についてはPlg1のN末への融合が本来の品質管理システムを阻害してしまうという問題が明らかになってきており、そちらについても的確な対処がまだできていない状態である。
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| 今後の研究の推進方策 |
ライフイベントについてはほぼ処理が進んでおり、現在のところ研究の進捗はほぼ正常に戻ってきているところである。知財申請についてはさまざまな手続きや実験が必要であったが、最終的に大学を通じての特許出願は見送る結論となったことから、いったん停止して今後の方向性を見直す段階になった。これらの状況から今後は実験の進行が進展することが期待できる。BioIDについては、当面、品質管理システムが機能しない（これはBioIDタグの融合がPlg1とE3リガーゼとの結合を阻害するための理解できる）ままで、ともかくリボソーム側にどのような因子がついているのかに着目して解析するように方針転換していく予定。またAPEXタグなど他のシステムについても並行して進め、近傍の因子の解明につとめようと考えている。
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