人工染色体技術を活用した脆弱X症候群関連染色体脆弱部位の機能解析とモデル系の構築

• 研究課題/領域番号: 22K06085
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分43010:分子生物学関連
• 研究機関: 鳥取大学
• 研究代表者: 中山 祐二 鳥取大学, 研究推進機構, 助教 (40432603)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円); 2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
• キーワード: 染色体工学 / 脆弱X症候群 / トリプレットリピート病 / 人工染色体

研究開始時の研究の概要

トリプレットリピート病に分類される遺伝性知的障害である脆弱X症候群は、責任遺伝子FMR1の5’非翻訳領域に存在するCGGリピートが、ある長さを閾値に母性伝播時に一気に伸長する結果、FMR1プロモーターおよびCGGリピート周辺領域が高度メチル化されFMR1遺伝子の発現が抑制されることで発症する。本研究では染色体工学を活用して、この一連のクロマチン動態と病態を正確に再現できる新しい病態モデルマウスを作製する。

研究実績の概要

脆弱X症候群（FXS: Fragile X syndrome）は最も頻度の高い家族性のX連鎖性知的障害であり、自閉症スペクトラム症の遺伝的モデルとしても注目されているトリプレットリピート病である。脆弱X症候群では、責任遺伝子FMR1の5’非翻訳領域に存在するCGGリピートが、ある長さを閾値に母性伝播時に一気に伸長する結果、FMR1遺伝子の発現が抑制されることで発症する。この一連のクロマチン動態がFXSの発症の根本的病因（CGGリピート動態と呼ぶ）である。しかし、CGGリピート動態を正確に再現できる解析系が現存しないため、CGGリピート動態のメカニズムや関わる分子などには不明な点が多い。CGGリピート動態の再現系構築のためには、染色体脆弱部位と呼ばれる、CGGリピートのような単純リピート配列をコアとして含み、実際にトリプレットリピート病の発症に関わる領域をそのまま実験室レベルで扱えるようにする必要がある。そして、もともと不安定な要素を持つ染色体脆弱部位を安定に取り扱える資材として整備し、かつトリプレットリピート病のような世代間解析を実現するためには、染色体導入動物作製までも可能である染色体医工学技術が最適であると考えた。そこで本研究では染色体工学を活用して、CGGリピートをコアとするFXSに関わる染色体脆弱部位を機能的ヒト染色体領域としてマウス人工染色体に搭載し(Fra-MACの構築)、Fra-MACをin vitroおよびin vivoの系に導入することでCGGリピート動態のメカニズムを包括的に明らかにするためのモデル系の作製を目指している。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

現在、脆弱X症候群の保因者由来のX染色体から、CGGリピート領域ならびにFMR1遺伝子座を包括する領域を本疾患に関わる「FXS脆弱部位」と定義し、この領域をマウス人工染色体に搭載する工程を進めている。マウス人工染色体へのFXS脆弱部位の搭載には、もともとの保因者由来のX染色体の改変と部位特異的組換えを利用する。染色体改変は続く部位特異的組換えのための事前準備を指し、部位特異的組換えに必要な組換え配列の挿入やFXS脆弱部位下流の不要な領域の削除など３工程がある。これらは全てCRISPR/Cas9系を用いて行い、一方の部位特異的組換えによる搭載にはCre/loxP系を利用し、すべてチャイニーズハムスターの細胞（CHO）内で実施している。初年度は染色体の改変を完了して、部位特異的組換えによるFXS脆弱部位の搭載へと工程を進めたが、搭載に成功したと思われる結果が得られていない。

今後の研究の推進方策

本研究は脆弱部位を搭載した人工染色体が構築されなければ研究計画を進めることが難しいため、来年度からもFra-MACの構築に注力していく予定である。この状況に対して、１）改変に関わるX染色体そのものを見直しつつ、２）部位特異的組換え誘導の別法の試行を組合わせて再試行している。１）については、使用している保因者由来のX染色体について、何らかの構造異常等の問題があると考え、別の保因者由来のX染色体のCHO細胞へのクローニングすることにも踏み切っている。また現資材を利用して、２）として、Cre発現ベクターの導入方法や組換えCreタンパク質の利用など、組換え効率の向上を目指して種々の再試行を続けている。さらに、３）として、ロードマップ内では最終年度にかけて行う予定であったより長い染色体領域の搭載（TAD包括Fra-MACの構築）も作業工程としては同じであり、同時並行で進めることとした。

研究成果

• [雑誌論文] TYRO3 promotes chemoresistance via increased LC3 expression in pancreatic cancer (2023)
  • 著者名/発表者名: Hara Kazushi、Horikoshi Yosuke、Morimoto Masaki、Nakaso Kazuhiro、Sunaguchi Teppei、Kurashiki Tatsuyuki、Nakayama Yuji、Hanaki Takehiko、Yamamoto Manabu、Sakamoto Teruhisa、Fujiwara Yoshiyuki、Matsura Tatsuya
  • 雑誌名: Translational Oncology 巻: 28 ページ: 101608-101608
  • DOI: 10.1016/j.tranon.2022.101608
  • 査読あり
• [雑誌論文] Epstein-Barr virus reactivation in peripheral B lymphocytes induces IgM-type thyrotropin receptor autoantibody production in patients with Graves’ disease (2023)
  • 著者名/発表者名: Nagata Keiko、Hayashi Kazuhiko、Kumata Keisuke、Satoh Yukio、Osaki Mitsuhiko、Nakayama Yuji、Kuwamoto Satoshi、Ichihara Yoshinori、Okura Tsuyoshi、Matsuzawa Kazuhiko、Miake Junichiro、Fukata Shuji、Imamura Takeshi
  • 雑誌名: Endocrine Journal 巻: 70 号: 6 ページ: 619-627
  • DOI: 10.1507/endocrj.EJ22-0609
  • ISSN: 0918-8959, 1348-4540
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Hsp70 promotes maturation of uromodulin mutants that cause familial juvenile hyperuricemic nephropathy and suppresses cellular damage (2022)
  • 著者名/発表者名: Utami Sulistiyati Bayu、Endo Ryo、Hamada Toshihiro、Notsu Tomomi、Minato Hiroyuki、Komatsu Koji、Nakayama Yuji、Shirayoshi Yasuaki、Yamamoto Kazuhiro、Okada Shinichi、Ninomiya Haruaki、Otuki Akihiro、Hisatome Ichiro
  • 雑誌名: Clinical and Experimental Nephrology 巻: Feb.25, 2022 号: 6 ページ: 522-529
  • DOI: 10.1007/s10157-022-02196-y
  • 査読あり
• [雑誌論文] Efficient human-like antibody repertoire and hybridoma production in trans-chromosomic mice carrying megabase-sized human immunoglobulin loci (2022)
  • 著者名/発表者名: Satofuka Hiroyuki、Abe Satoshi、Moriwaki Takashi、Okada Akane、Kazuki Kanako、Tanaka Hiroshi、Yamazaki Kyotaro、Hichiwa Genki、Morimoto Kayoko、Takayama Haruka、Nakayama Yuji、Hatano Shinya、Yada Yutaro、Murakami Yasufumi、Baba Yoshihiro、Oshimura Mitsuo、Tomizuka Kazuma、Kazuki Yasuhiro
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 13 号: 1 ページ: 1841-1856
  • DOI: 10.1038/s41467-022-29421-2
  • 査読あり
• [雑誌論文] A transchromosomic rat model with human chromosome 21 shows robust Down syndrome features (2022)
  • 著者名/発表者名: Kazuki Y, Gao FJ, Yamakawa M, Hirabayashi M, Kazuki K, Kajitani N, Miyagawa-Tomita S, Abe S, Sanbo M, Hara H, Kuniishi H, Ichisaka S, Hata Y, Koshima M, Takayama H, Takehara S, Nakayama Y, Hiratsuka M, Iida Y, Matsukura S, Noda N, Li Y, Moyer AJ, Cheng B, Singh N, Richtsmeier JT, Oshimura M, Reeves RH.
  • 雑誌名: The American Journal of Human Genetics 巻: 109 号: 2 ページ: 328-344
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2021.12.015
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Novel breeding method, matα2-PBT, to construct isogenic series of polyploid strains of Saccharomyces cerevisiae (2022)
  • 著者名/発表者名: Hirota Saeka、Nakayama Yuji、Itokazu Hodaka、Ekino Keisuke、Nishizawa Masafumi、Harashima Satoshi
  • 雑誌名: Journal of Bioscience and Bioengineering 巻: 133 号: 6 ページ: 515-523
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2022.02.003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Panel of human cell lines with human/mouse artificial chromosomes (2022)
  • 著者名/発表者名: Narumi Uno, Shuta Takata, Shinya Komoto, Hitomaru Miyamoto, Yuji Nakayama, Mitsuhiko Osaki, Ryota Mayuzumi, Natsumi Miyazaki, Chiaki Hando, Satoshi Abe, Tetsushi Sakuma, Takashi Yamamoto, Teruhiko Suzuki, Yoshihiro Nakajima, Mitsuo Oshimura, Kazuma Tomizuka, Yasuhiro Kazuki
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 12 号: 1 ページ: 3009-3009
  • DOI: 10.1038/s41598-022-06814-3
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 染色体工学技術応用（８）：人工染色体とゲノム編集技術によるＨＬＡ遺伝子の置換 (2022)
  • 著者名/発表者名: 中川和奏、森脇崇史、岸間菜々美、中山祐二、宇野愛海、冨塚一磨、香月康宏
  • 学会等名: 第45回日本分子生物学会年会
• [学会発表] 染色体工学を用いたFXSモデル動物の作製 －染色体へのFXS領域の搭載－ (2022)
  • 著者名/発表者名: 太田伊政、石川瑞樹、中山祐二、久郷裕之
  • 学会等名: 第45回日本分子生物学会年会
• [学会発表] 染色体工学を適用した脆弱X症候群責任脆弱部位のクローニング (2022)
  • 著者名/発表者名: 中山祐二、太田伊政、石川瑞樹、久郷裕之
  • 学会等名: 第45回日本分子生物学会年会