| 研究課題/領域番号 |
22K06102
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43020:構造生物化学関連
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
櫻木 崇晴 大阪大学, 免疫学フロンティア研究センター, 特任助教(常勤) (10867906)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
2024年度: 520千円 (直接経費: 400千円、間接経費: 120千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | Xkr8-Basigin複合体 / ナノディスク / 単粒子解析 / スクランブラーゼ / リン脂質スクランブリング / Xkr8 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
アポトーシス細胞では、通常細胞膜の内層に存在するリン脂質、フォスファチジルセリンが細胞表面に露出され食細胞による貪食を促す目印として作用する。この際、リン脂質を区別無く双方向に移層するタンパク質(スクランブラーゼ)、Xkr8-Basigin(BSG)複合体が働く。最近、Xkr8-BSG複合体の定常状態の構造解析から、リン脂質頭部の通過する“ポア領域”が見出されたが、活性化状態の構造は未知であり、Xkr8-BSG複合体がどのようにリン脂質をスクランブルするのか、未だ不明な点が多い。本研究では、活性化型のXkr8-BSG複合体の立体構造を決定し、リン脂質スクランブルの仕組みを解明する。
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| 研究実績の概要 |
アポトーシス細胞では、通常細胞膜の内層にのみ局在するリン脂質、ホスファチジルセリンが細胞表面に露出される。露出されたホスファチジルセリンは‘eat me’シグナルとして働き、マクロファージによる貪食を促進する。この過程で、リン脂質を区別無く双方向に移動(スクランブル)する膜タンパク質、Xkr8-Basigin複合体がホスファチジルセリンを細胞表面に露出させる。これまでに、定常状態のXkr8-Basigin複合体の界面活性剤ミセル内の構造解析から、リン脂質頭部の通過する“ポア領域”の候補を見出したが、活性化状態の構造は未知であり、Xkr8-BSG複合体によるリン脂質スクランブル機構は依然として不明な点が多い。そこで、活性化状態の構造決定が必要となるが、活性化状態のXkr8-Basigin複合体は定常状態と比べて不安定であることが問題である。そこで本研究では、Xkr8-Basigin複合体をナノディスクに再構築することを試みた。ナノディスクは界面活性剤ミセルと比べて、膜タンパク質が本来存在する脂質二重膜の環境に近いため、Xkr8-Basigin複合体を安定化できると考えたからである。ナノディスク作製条件を検討した結果、定常状態のXkr8-Basigin複合体については、効率良くナノディスクへ再構築する条件を発見した。さらに、このサンプルを低温電子顕微鏡で観察、単粒子解析を行うことにより、高分解能の密度図を得ることができた。今後は、ナノディスクに再構築したXkr8-Basigin複合体をカスパーゼにより処理することにより、活性化状態を誘導し、その構造を決定することを目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ナノディスクの作製方法を検討した結果、定常状態のXkr8/Basiginについては効率良くナノディスクに再構築することが可能となり、単粒子解析によって高分解能の密度図を得ることができた。今年度得られたナノディスク作製に関する知見は、今後、活性化型Xkr8/Basiginの構造を決定するための基礎となる。よって、本課題の進捗状況として、上記区分を選択した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は定常状態のXkr8/Basiginについてナノディスク内での単粒子解析に成功し、高分解能の密度図を取得した。来年度は活性化型のXkr8/Basiginの構造解析を進める。まずはナノディスクに再構築したXKR8/Basigin複合体をカスパーゼにより処理し、単粒子解析を試みる。並行して、活性化型変異体の解析も進める。これらの方法で上手くいかない場合に備え、活性化型構造を安定化するナノボディの開発も進める。最終的には、定常状態の構造と活性化状態の構造を比較し、Xkr8/Basigin複合体の活性化機構、およびこの複合体によるリン脂質スクランブルの機序を明らかにする。
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