| 研究課題/領域番号 |
22K06124
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43030:機能生物化学関連
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
近藤 裕史 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (50644655)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
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| キーワード | 血管内皮細胞 / モノクローナル抗体 / 毛細血管 / 周囲細胞 / 傍血管マクロファージ / 糖鎖生物学 / シングルセル解析 / heterogeneity |
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| 研究開始時の研究の概要 |
細胞膜に存在するタンパク質には様々な糖鎖が付加しており、その構造が修飾タンパク質の構造や機能を調節する。中でも細胞外O- GlcNAc糖鎖とその合成を担うEogt酵素は、酵素学的特徴に関してはよく解析されているが、生体内での働きに関しては不明な点が多い。血管組織においてEogtの発現が見られるが血管組織は多数の異なる細胞種で構成されており、細胞外O-GlcNAc糖鎖がどの細胞種で必要かについては判っていない。申請者は血管組織の周囲細胞においてEogtの限局発現を見出し、Eogtを欠くマウスではペリサイトの異常集積を観察した。そこで細胞外O-GlcNAc修飾による周囲細胞の機能調節の解明に挑む。
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| 研究実績の概要 |
本申請課題では細胞外O結合型Nアセチルグルコサミン（O-GlcNAc）糖鎖の付加酵素であるEogtの発現細胞の同定と、その細胞における意味付けである。初めに、Eogt発現細胞を同定するために様々な抗Eogt抗体を用い、マウス組織を対象に免疫組織染色を行った。その観察には高解像度共焦点レーザー顕微鏡を利用した。その結果、同一臓器内においても機能的に異なる領域に存在する血管が特異的に染色された。このことはひとえに血管といっても、糖鎖の観点から異なるサブセットが存在することを強く示唆するものである。さらに、様々な分子マーカーで染色したところ、Eogtを発現する血管の特徴化を明らかにすることができた。その血管は他の血管と比べてユニークであり、それがEogt発現たらしめる原理となる可能性が考えられた。そこでその血管に特徴的な外的刺激を培養血管内皮細胞に与えると、予想通り、Eogtの遺伝子発現の増加が認められ、その外的刺激に応答するEogt発現調節エレメントも同定することに成功した。そのユニークな血管特異的に赤色蛍光レポータータンパク質を発現させつつ、Eogtを欠失させるマウスを作製するため、LSL-tdTomato (Ai9)マウス、floxed Eogtマウス、ユニーク細胞特異的Creトランスジェニックマウスを交配させて目的のマウスを得た。現在、そのユニーク血管におけるEogtの機能を調べるため、病態発症マウスとの更なる交配を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
組織染色に使える抗Eogt抗体を割とすぐに見つけることができたため、予定より早くにEogt発現細胞のプロファイリングが可能になった。また、Eogtを発現誘導する外的要因についても、仮説通りとなり、順調に研究は進んでいるといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
上述した通り、高解像度共焦点レーザー顕微鏡にてペリサイトではなく、ユニークな血管内皮細胞においてEogtの特異的な発現を見出したことにより、本申請課題の目的１は達成された。ユニークな血管内皮細胞サブセットにおけるEogtの機能を、組織特異的誘導型conditional Eogt-KOマウスを解析することで明らかとする。当該マウスはすでに樹立済みであり、LSL-tdTomatoレポーターマウスとの交配によりEogtの発現とtdTomatoの発現細胞が一致することを確認できている。引き続き、その血管に着目したチャレンジ実験により、Eogtのその細胞特異的な機能を明らかとする。
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