| 研究課題/領域番号 |
22K06124
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43030:機能生物化学関連
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
近藤 裕史 名古屋大学, 医学系研究科, 講師 (50644655)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
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| キーワード | 血管 / 糖鎖 / シングルセル / transcriptome / O-GlcNAc / 血管内皮細胞 / モノクローナル抗体 / 毛細血管 / 周囲細胞 / 傍血管マクロファージ / 糖鎖生物学 / シングルセル解析 / heterogeneity |
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| 研究開始時の研究の概要 |
細胞膜に存在するタンパク質には様々な糖鎖が付加しており、その構造が修飾タンパク質の構造や機能を調節する。中でも細胞外O- GlcNAc糖鎖とその合成を担うEogt酵素は、酵素学的特徴に関してはよく解析されているが、生体内での働きに関しては不明な点が多い。血管組織においてEogtの発現が見られるが血管組織は多数の異なる細胞種で構成されており、細胞外O-GlcNAc糖鎖がどの細胞種で必要かについては判っていない。申請者は血管組織の周囲細胞においてEogtの限局発現を見出し、Eogtを欠くマウスではペリサイトの異常集積を観察した。そこで細胞外O-GlcNAc修飾による周囲細胞の機能調節の解明に挑む。
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| 研究実績の概要 |
初年度では本申請課題で着目する細胞外O-GlcNAc糖鎖を修飾するEogt糖転移酵素のマウスにおける組織発現分布を高解像度の共焦点レーザー顕微鏡にて解析し、特定の臓器の特定の血管において非常に強い染色が認められた。昨年度では細胞系譜追跡実験を行うため、当該細胞特異的に発現するCre deleterと、LSL-tdTomato (LoxP-STOP-LoxP-tdTomato)マウスを交配し、Tomato陽性細胞におけるEogtの染色を確認したところ、完全一致が認められ、細胞マーカーだけでなくlineage tracing実験においてもEogt陽性血管を同定することが出来た。更に、その血管からEogt陽性細胞の分離培養を確立し、hTERT (teromerase)にて不死化を行なった。その細胞を用いて、様々な刺激実験を行い、wild-typeとtissue-specific inducible Eogtノックアウト細胞において、遺伝子発現プロファイルを比較したところ、再現性よく、特定の遺伝子の発現に影響がみられ、更に、このことはwestern blottingでも確認できた。そこで、tissue-specific inducible EogtノックアウトマウスにTamoxifen投与を行い、in vivo deletionを行い、血管のwhole mount imagingを行ったところ、先日の分子の発現レベルが著しく低下していた。この分子は血管らしさを定義づけ、細胞間の同調に関わるため、現在、tissue-specific inducible Eogtノックアウトマウスに対し、様々なinsultsを付加した時の血管の振る舞いにつき、検証中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マウスの作製、血管からの細胞の分離培養、in vitroでのdeletion efficiencyなど、小さな障壁はところどころあるものの、基本的には一つずつクリアしていき、順調に実験を進められている。最終年度では論文投稿を行う。
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| 今後の研究の推進方策 |
RNA-seqによる網羅的遺伝子発現プロファイルの差異をwild-typeとtissue-specific inducible Eogt-KO cells間で比較を行う。同時並行で進めている、Click chemistryを用いた手段により、本contextにおけるEogtの修飾基質を同定する。in vivo insult modelを利用し、tissue-specific inducible Eogt-KOマウスの表現型解析を終える。
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