| 研究課題/領域番号 |
22K06141
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43030:機能生物化学関連
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
小原 圭介 名古屋大学, 理学研究科, 准教授 (30419858)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | 細胞膜 / 脂質非対称 / 脂質 / 膜タンパク質 / センサー / 酵母 / ユビキチン |
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| 研究開始時の研究の概要 |
細胞膜の脂質二重層では内外層で脂質組成や役割が大きく異なる。その様な「脂質非対称」は細胞の生存に必須である。申請者は、脂質非対称の状態をモニターするセンサータンパク質Rim21を出芽酵母で同定した。本研究では、Rim21が脂質非対称の状態をモニターする分子機構の解明を行う。また、申請者はRim21を利用して、生きた細胞で脂質非対称の状態をモニターできる脂質非対称バイオセンサーの開発も行っており、本研究で有用な知見が得られる。本研究の推進により、脂質とタンパク質の相互作用に関する新たなパラダイムが提供できるほか、真菌感染症の予防や治療に寄与する知見が得られると考えられる。
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| 研究実績の概要 |
細胞膜の脂質二重層では、内外層で脂質組成や役割が大きく異なっている。その様な「脂質非対称」は真核生物に共通して見られ、細胞の生存レベルで必須な重要事項である。研究代表者は、脂質非対称の状態変化を感知して適応反応を引き起こす脂質非対称センサータンパク質Rim21を出芽酵母で同定した。本研究では、Rim21が脂質非対称の状態変化を感知する分子機構およびそれを下流のタンパク質に出力する分子機構の解明を目指している。これまでにRim21のユビキチン化がこれらの過程に関わることを示唆する結果を得ているため、特にユビキチンの役割に着目して研究を遂行している。
昨年度からRim21が脂質非対称を感知するのに重要だと明らかにしたC末端細胞質領域（Rim21C）に関して、AlphaFold2に基づく構造予測によってその領域の開始点を再定義している（後方にシフト）。本年度は再定義した構造に基づき、ランダム点変異解析を行っており、Rim21C内やその他の領域における重要なアミノ酸残基の特定を目指している。その準備や条件検討が終わったところである。
ユビキチン化による脂質非対称シグナル伝達に関しては、これまでに関与を明らかにしたユビキチンリガーゼRsp5の点変異解析やデグロンによる一過的ノックダウン解析などを行ってきた。その結果、Rsp5がRim21を認識する際に重要であると考えられる部位を明らかにすることができた。また、Rim21のユビキチン化部位が既知の部位とは異なる新規の部位であること、その部位に対するユビキチン化が下流因子を呼び込むランドマークとして機能することを示唆する結果を得た。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
AlphaFold2による構造予測に基づいて、Rim21Ｃの領域を再定義した。更新した予測構造に基づいて、ランダム点変異解析を行っている。これにより、Rim21の機能に必須なアミノ酸残基を新たに特定することを目指している。Rim21の機能が失われた点変異体を簡便にスクリーニングするための条件を検討した。その結果、Rim21が機能を失うとカドミウム含有培地で生育可能になることを利用してスクリーニングを行うことで簡便に変異体を選別できることが明らかになった。実際のスクリーニング過程は進行中であり、まだ結論は得られていない。
Rim21C領域の再定義により、これまで用いていたRim21C組換えタンパク質も再定義した領域で合成する必要が出てきた。そのコンストラクト作りを行っているところである。新たなRim21C組換えタンパク質を用いて、脂質との結合実験を行う必要があり、その準備を行った。
Rsp5によるRim21のユビキチン化に関しては、新規のユビキチン化部位の特定を試みた。しかし、特定のリシン残基に対するユビキチン化が必須ではなく、ユビキチン化部位に関してはある程度の幅広い許容性があることを示唆する結果を得た。また、Rim21C内のPxxYモチーフがそれらの部位に対するユビキチン化に必須であることを明らかにし、そのモチーフがRsp5による認識配列であることを示唆した。
この様に、新たな進展が見られた一方で準備段階に留まっている実験もある。総合するとおおむね順調に進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に引き続いて、Rim21による脂質非対称の感知機構とユビキチン化を介したシグナル出力機構の解明を行う。
前者については、再定義したRim21Cの組換えタンパク質の大量発現と精製を行う。大腸菌やin vitro転写・翻訳系などの発現系を試行し、収量と純度の高い方法を採用する。得られた組換えタンパク質を用いて脂質との結合実験を行い、センサーモチーフが認識する脂質分子種やその組み合わせなどを明らかにする。これと並行して、ランダム点変異解析も継続する。これによりRim21の機能に必要なアミノ酸残基を新たに特定する。その中でRim21C内のアミノ酸残基に関しては、その変異を有するRim21C組換えタンパク質を用いた脂質結合実験をを行う。また、その変異を持つRim21を発現した細胞において、シグナル伝達がどこで滞っているかを評価し、そのアミノ酸残基が関わる素過程を明らかにする。
後者では、ユビキチン化されたRim21によりリクルートされるタンパク質を具体的に明らかにする。アレスチンタンパク質Rim8やESCRT I複合体因子などが候補として考えられる。Rim21のユビキチン化を抑制した条件で、これらのタンパク質の局在やRim21との物理的相互作用を調べる。これらの解析を通して、Rsp5によるRim21のユビキチン化を介した脂質非対称シグナルがRim21から次の分子へと出力される分子機構を解明する。
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