| 研究課題/領域番号 |
22K06173
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43040:生物物理学関連
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
平野 美奈子 岡山大学, ヘルスシステム統合科学学域, 准教授 (80585167)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | 光遺伝学 / イオンチャネル |
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| 研究開始時の研究の概要 |
近年、光照射によりcAMPを産生する天然の光活性化アデニル酸シクラーゼ（PAC）が細胞機能の光操作のツールとして注目されているが、その特性が正確に評価されていないため、PACの選択が限定され活用が進んでいない。本研究では、cAMP依存的に開閉するイオンチャネル（CNGチャネル）を利用して、PACが産生するcAMPの絶対量変化を高時間分解能で捉えて特性の調整機構を解明し、その部位を改変して細胞機能の光操作に適した新規PAC改変体群を創製する。本研究によりPACの細胞機能の光操作ツールとしての汎用性を高め、様々な生命現象の機序の理解や疾患の原因の解明へと繋げたい。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、cAMP依存的に開閉するイオンチャネル（CNGチャネル）を利用して、光活性化アデニル酸シクラーゼ（PAC）の特性の調整機構を解明し、細胞機能の光操作に適した新規PAC改変体群を創製することを目的としている。本年度は、PACが産生するcAMP量を捉えるのに適したCNGチャネルの選定を行った。詳細を下記に記す。
CNGチャネルの一種であるHCN2チャネルとSthKチャネルのcAMP感受性を比較した。これらのCNGチャネルをアフリカツメガエルの卵母細胞にそれぞれ発現させ、細胞内cAMP濃度の変化に伴うチャネル電流の変化を計測した。HCN2チャネルを発現させた卵母細胞では、フォルスコリンの添加または共発現させたPACへの光刺激によってcAMP産生を促さなくてもチャネル電流が捉えられ、これらの刺激によりcAMP量を高めてもチャネル電流に変化はなかった。一方、SthKチャネルでは、フォルスコリンの添加前後でチャネル電流に変化が見られた。ELISA法によるcAMP濃度の測定により、卵母細胞内には元々約1 μMのcAMPが存在していたことから、HCNチャネルは1 μM程度のcAMPで完全に活性化されると考えられる。一方、SthKチャネルが活性化された条件での細胞内cAMP濃度は200 μM以上であったことから、SthKチャネルは数100 μM以上のcAMPが活性化に必要なことがわかった。これらのことから、PACの特性を調べる際、活性が低い、つまり産生されるcAMP量が少ない場合にはHCN2チャネルを、活性が高い場合にはSthKチャネルを用いれば、特性を捉えられることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度、PACの特性を捉えるためのCNGチャネルのcAMP濃度依存性を明らかにすることができたため、今後この情報を基にPAC毎に適した種類のCNGチャネルを使うという道筋が立った。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回特性を調べたHCN2チャネルとSthKチャネルを昆虫細胞または大腸菌で発現・精製し、電気生理学的手法の一つである人工膜法でcAMP濃度依存的な変化が見られることを確認する。また、これら2つのCNGチャネルでカバーできないcAMP濃度を捉えるためのCNGチャネルを探し出す。その後、PACが光依存的に産生するcAMP量の変化を、人工膜に組み込んだこれらのCNGチャネルのチャネル電流の変化で捉え、PACの種類の違いによる特性の違いを明らかにする。得られた情報から特性に影響を与える部位を改変し、光応答能などを高めた変異体を作製してPACのオプトジェネティクスツールとしてのバリエーションを広げる。
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