研究課題/領域番号 |
22K06179
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研究種目 |
基盤研究(C)
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配分区分 | 基金 |
応募区分 | 一般 |
審査区分 |
小区分43050:ゲノム生物学関連
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研究機関 | 東京大学 |
研究代表者 |
佐藤 祥子 東京大学, 定量生命科学研究所, 助教 (90624966)
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研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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キーワード | ヘテロクロマチン / エピジェネティクス / ヌクレオソーム / クライオ電子顕微鏡 |
研究開始時の研究の概要 |
真核生物のゲノムDNAは、H2A、H2B、H3、H4からなるヒストン八量体にDNAが巻き付いたヌクレオソームを基本単位としてクロマチンを形成し、高次に折りたたまれて細胞核に収納されている。遺伝子を多く含み転写活性化したユークロマチン領域に対し、構成的ヘテロクロマチン領域は、繰り返し配列や転写が抑制された領域を多く含み、ゲノムの安定性に寄与している。本研究は、構成的ヘテロクロマチンのエピジェネティックマークの書き込み酵素を含むクロマチンを試験管内で再構成し、立体構造を解析することにより、ヘテロクロマチン維持の機構を明らかにしようとするものである。
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研究実績の概要 |
真核生物のゲノムDNAは、ヒストンH2A、H2B、H3、H4からなるヒストン八量体にDNAが巻きついたヌクレオソームを基本単位としたクロマチンを形成し、細胞核内に収納されている。遺伝子を多く含み転写活性化したユークロマチンに対し、繰り返し配列を多く含む構成的ヘテロクロマチンは、転写やDNA組換えが抑制されゲノムの安定化に寄与していると考えられている。本研究は、構成的ヘテロクロマチンのエピジェネティックマークの書き込み酵素を含むクロマチンを試験管内で再構成し、クライオ電子顕微鏡を用いて立体構造を解析することにより、ヘテロクロマチンの形成と維持の機構を明らかにすることを目的としている。 2022年度は、構成的ヘテロクロマチン領域のヒストンH3の9番目のリシン残基にメチル基を導入する(H3K9me2/3)ヒストンメチル基転移酵素がクロマチン上でヌクレオソームをメチル化する機構を解析するため、ヒストンメチル基転移酵素を精製した。また、H3K9me2/3に適したクロマチン基質を検索するため、様々なヌクレオソームを試験管内において再構成した。精製したヒストンメチル基転移酵素に対し、試験管内で再構成したヌクレオソームを基質としたメチル化活性試験および結合性試験を行い、ヒストンメチル基転移酵素によるH3K9me2/3が効率的に起こるヌクレオソーム基質を見出すことに成功した。クライオ電子顕微鏡観察に必要量のヒストンメチル基転移酵素-ヌクレオソーム複合体を調製するため、精製系の構築を進めた。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
構成的ヘテロクロマチン領域のヒストンH3の9番目のリシン残基にメチル基を導入するヒストンメチル基転移酵素の精製に成功した。試験管内再構成ヌクレオソームを基質としたヒストンメチル化活性試験を行なった結果、精製したヒストンメチル基転移酵素が活性を有することを確認することができた。また、試験管内再構成ヌクレオソームを用いてヒストンメチル基転移酵素との結合性試験を行った結果、ヒストンメチル基転移酵素とヌクレオソームとの結合を確認することができた。これらの混合物から、クライオ電子顕微鏡解析に適したヒストンメチル基転移酵素-ヌクレオソーム複合体を精製するための条件を検討することができたため、2022年度は、概ね順調に研究が進展した。
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今後の研究の推進方策 |
2023年度は、クライオ電子顕微鏡によるヒストンメチル基転移酵素-ヌクレオソーム複合体の立体構造解析を行なう。2022年度に引き続き、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析に適したヒストンメチル基転移酵素-ヌクレオソーム複合体を精製するため、試験管内における複合体の再構成時の試料濃度、架橋、精製方法の検討を行う。また、クライオ電子顕微鏡観察用試料を作製する際の試料濃度、溶媒組成、グリッドの種類、凍結条件の検討を行う。観察に適した試料が作製でき次第、クライオ電子顕微鏡を用いてデータを取得し、構造解析を行う。クライオ電子顕微鏡による立体構造解析に加え、クロスリンク質量分析法を用い、ヒストンメチル基転移酵素とヌクレオソームとの複合体におけるタンパク質間相互作用を明らかにする。
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