| 研究課題/領域番号 |
22K06290
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分44040:形態および構造関連
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
岡本 直樹 筑波大学, 生存ダイナミクス研究センター, 准教授 (10577969)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | ペプチドホルモン / ショウジョウバエ / 形状変化 / カルシウム恒常性 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
多細胞生物の発生過程において、体全体や組織の『かたち』は時期特異的に変化を遂げ、その結果、最終的に決まった『かたち』を持つ個体が形成される。本研究では、遺伝的にプログラムされたダイナミックな形状変化イベントのモデル系として、完全変態昆虫に共通する幼虫から蛹への『体全体の形状変化』の調節機構の解明を目指す。モデル生物であるキイロショウジョウバエを用いて、昆虫変態時に体表筋肉で生じる収縮機構と、それを誘導する神経ペプチドホルモンの時期特異的な作用調節機構を包括的に解明することにより、時期・組織特異的なホルモンの作用が、筋肉の収縮を介して体全体の『形状の変化』を誘導するメカニズムを明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
多細胞生物の発生過程において、体や組織の『かたち（形態および形状）』は時期特異的に変化を遂げ、最終的に決まった『かたち』を持つ個体になる。本研究では、分子遺伝学的技術に長けたショウジョウバエを用いて、幼虫から蛹への体の形状変化に関与する内分泌機構の理解を目指している。蛹化時の形状変化に関わるペプチドホルモンとして見出したCapaは、昨年度の研究により、カルシウム（Ca）の恒常性を調節するホルモンであることが示唆された。そこで本年度は、当初の研究計画から一部変更し、以下の解析を進めた。
1. Ca欠乏時の応答：ショウジョウバエ用の合成培地を改変し、Caを含まない（Ca-free）培地の作製に成功した。Ca-free培地で幼虫を飼育した結果、Ca枯渇期間と比例して、体液中Ca濃度、運動能が著しく減少した。その結果、蛹化した個体は、筋収縮に異常をきたし、細長い形状の蛹になることを見出した。さらに、これらの特徴は、CapaやCapa受容体のノックダウン（KD）個体の表現型と全て一致した。
2. Capa分泌機構：CapaがCa動員ホルモンである場合、その分泌は低Ca時に誘導されることが予想される。そこで、Ca-free培地で飼育時のCapa産生神経におけるCapa貯蓄量、神経活性を解析した結果、Capaの分泌が低Ca時に誘導されることが示唆された。
3. Ca貯蔵器官へのCapaの作用： Capaはマルピーギ管（MT）の先端領域に作用することから、MTの先端領域を走査型電顕解析、イオン組成分析した結果、MTの内腔にCaイオンで主に構成される顆粒が蓄積していることを見出した。さらに、摘出したMTを合成したCapaと共に組織培養した結果、Ca貯蔵量が減少することを明らかにした。
以上の結果から、CapaがCa貯蔵器官に作用し、体液中へのCa放出を促すホルモンとして機能することが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
計画当初、Capaは筋肉に作用することで蛹化時の形状変化を調節すると予想していたが、昨年度の研究により、Capaはマルピーギ管（MT）の先端領域に作用することが明らかになった。さらに、Capaは体液中のカルシウム（Ca）恒常性を調節するホルモンであることを示唆する結果が得られたことから、本年度は、当初の計画から一部を変更して解析を進めた。特に大きな進展があったのが、電顕解析やイオン組成分析などにより、MTの先端領域がCa貯蔵器官であることを証明したことである。脊椎動物のCa貯蔵器官は骨であるが、骨のないショウジョウバエにおいてもCa貯蔵器官が存在するという発見は非常に大きなインパクトをもたらすと考えられる。Ca貯蔵器官の組織培養系を開発することにより、Capaが直接Ca貯蔵器官に作用し、体液中へのCa放出を促すホルモンとして機能することを示した。また、当初計画していなかった幼虫の行動解析を遂行することにより、これまで着目していた蛹の形状変化だけではなく、運動能、筋収縮など複数の表現型において、Ca欠乏時の応答やCapa/Capa受容体のKD個体の表現型を解析することが可能となった。これらの比較解析によって、Capa/Capa受容体のKD個体の表現型は体液中のCa低下が原因であることを結論付けることができた。脊椎動物において、血中のCa恒常性の中心として働くのは副甲状腺ホルモン（PTH）である。一方、昆虫をはじめとする無脊椎動物においてもCaは必須にも関わらず、PTHホモログが存在しないことから、Ca恒常性を担う内分泌機構は多くが謎であった。本研究結果は、骨もPTHもない無脊椎動物におけるCa恒常性の謎に迫る極めて重要な成果であり、現在、投稿論文の準備中である。以上のように、当初の計画とは一部を変更して研究を進めているが、当初の計画以上の極めて重要な研究進展が得られた。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の解析により、CapaはCa貯蔵器官に作用し、体液中へのCa放出を促すホルモンとして機能することを明らかにした。これについては投稿論文の準備中である。一方で、Capaの作用により、貯蔵Caが体液中へ放出されるメカニズムは不明である。MTの先端領域にはCa顆粒としてCaが蓄積していることから、何らかの機構によりCa顆粒が溶解し、Caイオンが体液中に排出すると予想される。
そこで、この重要な疑問を解明するため、当初の研究計画から変更し、以下の解析を進める。
1. CapaのMTへの作用機構：MTの先端領域において、CapaRの下流でどのようなシグナル伝達経路が活性化し、貯蔵Caの溶解・排出が誘導されるのかを明らかにする。予備的実験により、CapaRの下流でGαqが機能することを見出していることから、Gαq -PLCシグナル伝達経路に関わる様々な因子のKDを行い表現型の解析を行う。貯蔵Ca量だけではなく、蛹の形状、運動能、体液中のCa濃度を指標とする。
2. 貯蔵Caの溶解・排出機構： Ca顆粒は酸性化で溶解することから、pHの変化が重要であると考えられる。予備的実験により、Capa作用によりCa顆粒がMTの基部領域や後腸に向かって流動すること、Ca排出輸送体（PCMA）が、MT及び後腸において高発現することを見出している。MTの基部領域や後腸は、MTの先端領域と比較してpHが低いことから、Ca顆粒がMTの基部領域や後腸に流動しながら溶解し、Caイオンが体液中に排出される可能性が考えられる。そこで、組織培養系を用いてCapa作用によるCa顆粒の流動への影響をイメージング解析する。CapaRや上記解析で得られたシグナル伝達経路に関わる因子のKD個体から摘出した組織も解析に用いる。さらに、MTや後腸特異的にPCMAをKDした個体を用い、貯蔵Caの排出機構を解析する。
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