研究課題
基盤研究(C)
生物の組織間のコミュニケーションは免疫、成長、あるいは恒常性の維持など、生命システムを維持するのに重要である事が分かっている。その知見に加え、最近では記憶・学習を担う神経系が非神経系と多様なコミュニケーションする事で、脳機能が機能するという新しい知見が報告されて来た。しかし、その実体となる分子や分子メカニズムに関してはほとんど分かっていない。本研究では既に全神経ネットワーク構造が明らかとなっている線虫を用いて、非神経系で機能し、神経機能に影響を与える分子同定及びその分子メカニズムを明らかにする。これらの研究により、動物の全身性情報処理による行動制御機の仕組みが明らかになると期待される。
本研究は学習による行動制御において、神経系－非神経系の間ではたらく分子を同定し、その仕組みを明らかにすることを目指している。エサとともに23度で飼育された線虫は23度が好きな温度として記憶し(学習)、温度勾配上に置かれてから30分程度で23度に向かう走性行動を示す。これまでの研究により、皮膚細胞(seam cell)で発現する糖転移酵素GLY-12(哺乳類GnTI)が学習に依存した温度走性行動に関与することが明らかとなっている。線虫では哺乳類GnTIと相同するgly-12，gly-13， gly-14が存在しており、これらは温度神経回路を構成する神経細胞ではなく、皮膚細胞、腸、筋肉などそれぞれ異なる組織で発現することがわかった。また、これら遺伝子のアミノ酸配列は約40％以上の相同性を示すことから、gly-12欠損株にgly-13やgly-14を皮膚細胞に異所発現することにより、温度走性行動の異常が回復するかを調べたところ、温度走性行動において、gly-13はgly-12機能を果たしていることがわかった。一方、GLY-12により糖鎖修飾されるターゲット分子としてペプチド性伝達物質のプロセシング酵素であるEGL-3に注目し、ELG-3のアミノ酸配列から糖が添加される３つのアスパラギンをアラニンに置換し、温度走性行動への影響を調べた結果、温度走性行動に異常を示すことからEGL-3の糖転移が重要であることが新たにわかった。gly-12とegl-3の二重変異株と単独変異株を用いた温度走性行動の実験により、gly-12とegl-3は遺伝学的関係性があることも新たにわかった。現在、GLY-12がEGL-3の糖添加に直接関与するか調べる実験を遂行中である。
2: おおむね順調に進展している
これまでの研究により、学習に依存した温度走性行動制御に皮膚細胞でのEGL-3の機能が必要であることが明らかになっている。しかしながらどの糖鎖修飾関連分子がEGL-3分子に糖を添加するかはまだわかっていない。本研究では糖鎖修飾酵素のGLY-12が EGL-3のアスパラギン残機に糖を添加するか生化学的実験を用いて確かめる。まず、ゲノム編集により、egl-3の3’末端にFLAGタグ配列を挿入し、野生株やgly-12(id47)欠損株でのEGL-3::FLAGタンパク質を精製する。現在、CRISPR-Cas9により、flag 配列の挿入に成功しており、温度走性行動において野生株と同様に異常は示さなかった。今後、このSI[egl-3::flag]株(野生株)と、gly-12(id47); SI[egl-3::flag]株(gly-12欠損株)からEGL-3を分子・精製し、野生株とgly-12欠損株でEGL-3の糖鎖の程度を比較する。現在、糖タンパク質検出のための更なる条件検討を遂行中である。EGL-3は複数の細胞で発現するが、機能的なEGL-3::FLAGと糖タンパク質を検出できるために大量のタンパク質を精製する必要がある。また、皮膚細胞が温度神経回路と相互作用し温度走性行動を制御する新しい知見が得られているため、皮膚細胞の活性化もしくは不活性化が線虫の行動を変化させるかを確かめる実験を行っている。gly-12が機能する皮膚細胞の特異的に発現を誘導するプロモーターを用いて、チャネルロドプシンを発現させた株をすでに製作し、光遺伝子学を利用した実験条件を検討している。
温度走性行動の制御において、ペプチド性伝達物質のプロセシング酵素であるEGL-3の活性化に糖転移酵素GLY-12が必要であるかを確かめる実験を優先的に行う。また、皮膚細胞で主に発現し、EGL-3によって生産させる低分子ペプチドに注目し、どのペプチドが温度走性行動の制御に関与するか調べる。現在、シングルセル発現プロファイル(CeNGEN.org)からいくつかの候補ペプチド遺伝子に注目し、それぞれの欠損株を製作およびCGC(Caenorhabditis Genetics Center)やNBRP(National BioResource Project)から取り寄せている。また、線虫の行動制御は神経系ではなく、皮膚細胞は（もしくは神経細胞との相互作用によって）行動を制御するという仮説をたて、光遺伝学的手法を用いて線虫の行動解析を行う。行動解析には我々が独自に開発してきた、オプトジェネチックスを利用した多個体の行動解析装置を用いて、線虫の行動要素の前進、後退、ターン、停止など定量化する。また、これらの行動要素はgly-12欠損株のと比較することで、GLY-12が皮膚細胞の行動制御に関与するかを確かめる。
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