| 研究課題/領域番号 |
22K06335
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分45010:遺伝学関連
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
柴田 武彦 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (70087550)
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| 研究分担者 |
廣田 耕志 東京都立大学, 理学研究科, 教授 (00342840)
正井 久雄 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 所長 (40229349)
笹沼 博之 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 副参事研究員 (00531691)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
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| キーワード | 相同DNA組換え / 相同DNA対合 / RecA/Rad51族組換え酵素 / ハイブリッド二本鎖 / 相同三重鎖 / 組換え中間体 / ヘテロ二重鎖DNA / ハイブリッド二重鎖DNA / 相同対合反応 / RecA / Rad51 / 相同組換え修復 / 相同並行三重鎖 / ハイブリッド二重鎖 / Ｄループ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
相同的組換えがDNA二本鎖切断を正確に修復してゲノムを維持する。相同的組換えの要は、切断端からできる単鎖(ss)DNA域が二重鎖(ds)DNAの中から互いに相同な配列を見つけハイブリッドds (Hyb-ds) を作る反応である。この反応の仕組みは未だに定説がない。ある酵素がdsDNAの塩基対を開き、できたss域で相手のssDNAとアニールしてHyb-dsをつくる「二重鎖開裂が先」モデルと、逆に、ds構造が開く前にssDNAとの相同配列が見つけ出される「二重鎖開裂が後」モデルとがある。本研究では「二重鎖開裂が後」モデルにだけ想定される「相同並行三重鎖」の存在を示すことで、このモデルの確証を得る。
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| 研究実績の概要 |
RecAがdsDNAの塩基対を開き、できたss域で相手のssDNAとアニールしてハイブリッド二本鎖 (Hyb-ds) をつくる「二重鎖開裂が先」モデルと、逆に、ds構造が開く前にssDNAとの相同配列が見つけ出される「二重鎖開裂が後」モデルとがある。RecAによるHyb-ds 形成で最初にできる6-8塩基程度の核が、「二重鎖開裂が後」モデルに特有な相同並行三重鎖であることを示すことで「二重鎖開裂が後」モデルが正しいことを示す証拠を得ることが、本研究の目的である。そのためには、高感度二本鎖DNA巻き戻しアッセイと共に、Hyb-ds核形成の機能を保ちながら、その核をＤループへ変換し、成長させるRecAの第2の機能を抑制できるかが鍵になる。
a. Hyb-dsの核をＤループへ変換し、成長させるRecAの第２の機能を抑制し、Hyb-ds核形成段階でトラップするためのrecA変異体候補として、Yangらのクライオ電子顕微鏡解析(Nature 2020) の結果から明らかになった、Ｄループの両端で二本鎖DNAの解列を安定化しているL2ループ先端のPhe203をAlaに置換したF203A変異をもつrecA変異体を精製して、Ｄループ形成への影響を解析した。その結果、F203A変異recAでもＤループを形成することが分かり、Phe230による二本鎖DNA解列はＤループ形成に必須ではないことがわかった。
b. 高感度ds巻き戻しアッセイ系を開発して、RecA野生型によるＤループ形成過程での二本鎖DNAの巻き戻しを解析した。その結果、一本鎖DNAとの相同配列を探している段階では、3000塩基対の二本鎖DNAは1回転の巻き戻しも起こらず、互いに相同な塩基配列を識別した後に初めて二本鎖DNAの巻き戻しが起こることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究実績の概要のa とb で述べた結果は、「二重鎖開裂が先」モデルとは相いれず、「二重鎖開裂が後」モデルを支持する。この結果は、「二重鎖開裂が後」モデルが正しいことを示す証拠と言える。これらの結果をまとめた論文は、2023年年末に、Nucleic Acids Research 誌 (IP: 19) に受理され、2024年の初頭に出版された。
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| 今後の研究の推進方策 |
野生型RecAはＤループを精製したのち、ATP加水分解に依存してできたＤループを一本鎖DNAの5'-3'へ移動させて解離する「Ｄループ加工」活性を合わせて持つ。Hyb-dsの核をＤループへ変換し、成長させるRecAの第２の機能を抑制し、Hyb-ds核形成段階でトラップするためのrecA変異体候補として取得、精製した、Ｄループの両端で二本鎖DNAの解列を安定化しているL2ループ先端のPhe203をAlaに置換したF203A変異をもつrecA変異は、Ｄループは形成するが、できたＤループを解離することができないことが分かった。その結果、F203は、むしろ、相同三重鎖をＤループに成熟させる機能をもつ可能性が、また、203A変異はHyb-ds核形成段階でトラップする可能性が示唆された。さらに、相同三重鎖とＤループとを区別する手法を導入し、この課題の目的である相同三重鎖の存在の検証を行う。
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