| 研究課題/領域番号 |
22K06457
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分46020:神経形態学関連
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
金子 涼輔 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 准教授 (40390695)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
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| キーワード | 神経回路形成 / 小脳 / プロトカドヘリン / 遺伝子改変マウス / 脊髄小脳変性症 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、問い「登上線維は、自身と同一の細胞個性を持つプルキンエ細胞と結合するか？」に答える。具体的には以下３課題を行う。
a)特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作するマウスの開発
b)プルキンエ細胞と下オリーブ核におけるcPcdh発現解析
c)結合する登上線維とプルキンエ細胞におけるcPcdh発現解析
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| 研究実績の概要 |
本研究は申請者らの発見した「プルキンエ細胞個性」を足がかりとして、「登上線維が如何にして結合するプルキンエ細胞を選択するか？」に答える。
個々のプルキンエ細胞に結合する登上線維は1本のみである。この特異的結合はシナプス刈り込みを経て形成されるが、結合パートナーの選択メカニズムには不明な点が多い。申請者らは、クラスター型プロトカドヘリン(cPcdhα、β、γ。58種の多様化した細胞接着分子群)の、個々のプルキンエ細胞ごとに異なる組み合わせ発現を発見した。すなわち、個々のプルキンエ細胞にはcPcdh発現パターンの違いが作る「個性」がある。本研究では、このプルキンエ細胞個性の役割解明を目的として、プルキンエ細胞とそれに結合する登上線維におけるcPcdh発現パターンを明らかにする。
今年度は、問い「登上線維は、自身と同一の細胞個性を持つプルキンエ細胞と結合するか？」に答えるための準備段階として、計画している課題a, b, cのうちの課題a)特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作するマウスの開発に成功した。具体的には58種のcPcdhのうち特定の1種（cPcdhα2）を発現する細胞の可視化と、その細胞での遺伝子操作が可能なマウスである。昨年度までに完成していた14種類のcPcdha遺伝子の発現細胞にてtdTomatoとCreER(薬剤誘導型Cre-loxP組換え酵素)に対してゲノム編集を行い、cPcdhα2発現細胞のみがtdTomatoとCreERを発現するよう改変した。本マウスの脳を観察したところ、内在性cPcdhα2発現と同様のtdTomatoパターンが見られた。本マウスは特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作可能な世界初のマウスである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究では、問い「登上線維は、自身と同一の細胞個性を持つプルキンエ細胞と結合するか？」に答える。具体的には以下３課題を行う。a)特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作するマウスの開発。b)プルキンエ細胞と下オリーブ核におけるcPcdh発現解析。c)結合する登上線維とプルキンエ細胞におけるcPcdh発現解析。
現在までに、本研究遂行の上で必須となる、課題aが順調に進展している。具体的には、58種のcPcdhのうち特定の1種（cPcdhb3）を発現する細胞を可視化可能なマウスの作製に成功している。さらに、cPcdhα2を発現する細胞の可視化と、その細胞での遺伝子操作が可能なマウスの作製に成功した。
さらに、当初の予定よりも早くに課題bおよび課題cを進めている。課題bでは、プルキンエ細胞ならびに下オリーブ核におけるcPcdha2発現を、上記課題aにて作製したマウスにて可視化可能なことを見出した。また、課題cで用いる実験手法の実験技術を向上している。具体的には、登上線維を蛍光標識できる実験条件を見出した。すなわち、Cre依存的に緑色蛍光タンパク質GFPを発現するアデノ随伴ウイルスベクターを用いる。このウイルスベクターを下オリーブ核へ投与する手法（針の長さ、挿入角度、挿入深さ）を精査し、安定して下オリーブ核へ投与できる条件を見出した。
以上のように、当初の計画から前倒しで予定していた３課題全てを実施しており、いずれについても期待通りの結果が得られているため、当初の計画以上に進展していると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、本研究で計画している３課題、a)特定のcPcdh発現を可視化し、その細胞の遺伝子発現を操作するマウスの開発。b)プルキンエ細胞と下オリーブ核におけるcPcdh発現解析。c)結合する登上線維とプルキンエ細胞におけるcPcdh発現解析のうち、課題aに特に注力して進める。具体的には、2023年度に得られたcPcdha2発現細胞の可視化と遺伝子発現操作が可能なマウスの交配、サンプリング、脳切片観察を行い、本マウスでのtdTomatoおよびCreER発現が内在性のcPcdha2発現を反映しているかを明らかにする。目的を満たすマウスが得られ次第、課題b、課題cを実施する。
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