| 研究課題/領域番号 |
22K06581
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分47030:薬系衛生および生物化学関連
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| 研究機関 | 東北医科薬科大学 |
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研究代表者 |
菅原 栄紀 東北医科薬科大学, 薬学部, 講師 (50405916)
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| 研究分担者 |
井ノ口 仁一 東北医科薬科大学, 薬学部, 特任教授 (70131810)
藤村 務 東北医科薬科大学, 薬学部, 教授 (70245778)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | レクチン / 細胞内輸送 / Rab ファミリー / 糖脂質 / precision medicine |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ナマズの未受精卵中から発見されたレクチン（Silurus asotus lectin, SAL）はバーキットリンパ腫や子宮頚がん，腎がんなどの細胞膜表面において発現が増加している糖脂質Gb3と特異的に結合することで，がん細胞の内部に取り込まれることを見出している．さらに，SALは抗がん剤の効果を増強させる効果も有している．そこで本研究では，がん細胞内にSALが取り込まれる分子メカニズムを解明することと共に薬剤融合SALの作製および有用性の検討を行い新規がん治療方法の開発を目的とする．
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は，がん細胞内にSALが取り込まれる分子メカニズムを解明することと共に薬剤融合SALの作製および有用性の検討を行い新規がん治療方法の開発することである．ナマズ卵レクチン（SAL）は，ヒト子宮頸がん由来細胞株HeLaの細胞膜表面上に発現しているGlobotriaosylceramide（Gb3）に結合し細胞内に取り込まれ，その後ゴルジ体から出芽し膜構成分にLAMP1を有するリソソーム様小胞（LLV）の周囲に集積する．本年度は，しかし，取り込みから集積に至るまでの詳細な機構については不明であった．今回我々は，HiLyte標識したSAL（HL-SAL）を作製し，HeLa細胞内におけるSALの取り込みから集積に至るまでの詳細な機構を解析した．HL-SALは，処理後1 時間から取り込みが開始され，その後取り込み量の増加とともに処理後6時間からLLVの形成およびLLVへのSALの集積が起こり始めることが確認された．この時ゴルジ体との共局在は見られなかった．次に，Rabファミリーに着目し，GFP融合Rab5およびRab7を強制発現させてHL-SALの局在を検討した．HL-SALはRab5およびRab7と部分的に共局在を示し，Rab7はLLVの膜上に発現していることも分かった．さらにエンドソーム膜融合阻害剤Wortmanninおよびエンドソーム内のpH低下に関与するV-ATPaseの阻害剤であるBafilomycin A1（BafA1）を用いて検討した結果，Wortmannin処理によりHL-SALのLLVへの集積が阻害された．一方，BafA1処理ではLLVの増大が抑制され，未成熟型のLLVにHL-SALの集積が認められた．本結果は，SALは細胞内に取り込まれた後，Rab5が存在する初期エンドソームを介してLLVと融合し，その膜上に集積する可能性が示された．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和４年度の研究計画は，HiLyte標識したSAL（HL-SAL）を作製しSALの細胞内輸送経路を解明することである．令和４年度は，GFP融合Rab5およびRab7を強制発現させてSAL取り込みにおけるRabの関与およびエンドソーム膜融合阻害剤Wortmanninおよびエンドソーム内のpH低下に関与するV-ATPaseの阻害剤であるBafilomycin A1（BafA1）を用いてSALの細胞内輸送経路を解析した．本研究では，細胞内に取り込まれたHL-SALは，Rab5およびRab7と部分的に共局在を示し，Rab7はLLVの膜上に発現していることも分かった．また，Wortmannin処理によりHL-SALのLLVへの集積が阻害された．一方，BafA1処理ではLLVの増大が抑制され，未成熟型のLLVにHL-SALの集積が認められた．本年度の成果は，SALは細胞内に取り込まれた後，Rab5が存在する初期エンドソームを介してLLVと融合し，その膜上に集積する可能性を示している結果であり，令和４年度の研究がおおむね順調な理由である。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和４年度に行った研究から，SALは細胞内に取り込まれた後，Rab5が存在する初期エンドソームを介してLLVと融合し，その膜上に集積する可能性が示した．しかし，Rab5および7がHeLa細胞におけるSALの細胞内輸送に関与しているか否かについては明らかにすることはできなかった．HeLa細胞にはRab1A，2A，4A，5A，６A，7A，9Aおよび11Aが発現していることを明らかにしている．今後は，これらをRNA干渉によりノックダウンした細胞を作製し，SALの取り込みおよび細胞内輸送に関与するRabを明らかにする．これによりSALの細胞内輸送経路の裏付けを行う．さらに，細胞内に取り込まれたSALが分解されるまでの時間および分解機序の解明にも取り組むこともSALを治療に応用する場合には重要であるためSALの細胞内動態を明らかにし，効果的に薬物を送達するキャリアになりうることを確認する．
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