| 研究課題/領域番号 |
22K06584
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 配分区分 | 基金 |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 審査区分 |
小区分47030:薬系衛生および生物化学関連
|
|---|
| 研究機関 | 帝京大学 |
|---|
研究代表者 |
山下 純 帝京大学, 薬学部, 教授 (80230415)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
|
| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
|
|---|
| キーワード | GPR55 / リゾホスファチジルイノシトール / リゾリン脂質 / GPCR / 生理活性脂質 / 免疫・炎症反応 / 炎症・免疫細胞 / CB1 ＆CB2 |
|---|
| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、(1)炎症・免疫細胞のどの細胞にGPR55が発現しているか？ (2) 免疫細胞のどの機能にLPI-GPR55が関与しているか？ (3) LPI-GPR55のコンカナバリンA（ConA）誘発性肝炎への影響 (4) ConA誘発性肝炎における新規LPIの産生機構について (5)LPI-GPR55と細胞接着 (6)GPR55とCB2受容体との相互作用 などの課題を一つずつ克服しながら「GPR55が炎症・免疫に関与する」ことを証明する。GPR55とその関連受容体の性状解析を行うことで、受容体アゴニストやアンタゴニストとして作用する薬物も探索したい。
|
| 研究実績の概要 |
私たちはカンナビノイド受容体CB1とCB2の内在性アゴニストの探索を行い、アラキドン酸含有グリセロールである2-アラキドノイルグリセロール（2-AG）を同定した。その後、CB1とCB2以外のカンナビノイド受容体の存在が報告され、Gタンパク質共役型受容体GPR55が同定された。私たちはGPR55の内在性アゴニストの探索も行い、リゾホスファチジルイノシトール（LPI）、特に活性の高いアゴニストとして2-アラキドノイルLPIを同定した。GPR55は脳に多く存在するオーファン受容体として同定され、ついで新規カンナビノイド受容体として報告された経緯から、GPR55が脳で働くことが想定されていた。本研究ではGPR55の真の機能を探るため、マウス臓器・細胞での発現を検討した。GPR55は、脳にも発現はしていたが、その発現量は低いもので、精巣、消化管（小腸、大腸）、リンパ節、脾臓などに高発現していた。また、脾臓と小腸の細胞をさらに分画すると、GPR55は脾臓の場合はB細胞やT細胞などのリンパ球や樹状細胞に、小腸の場合は上皮内リンパ球に多く発現し、炎症・免疫に関与する細胞に高発現することが分かった。GPR55は精巣に非常に高発現していたが、精巣の細胞を分画すると、精子形成細胞の精製に従ってGPR55の発現量が低下し、セルトリ細胞など体細胞に高発現していることを示す。セルトリ細胞はアポトーシスを起こした精子などを貪食し炎症・免疫に関与する。これらの知見は「GPR55は炎症・免疫に関与する」ことを示すと考えられる。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１）マウス臓器のGpr55の発現解析 マウス臓器から総RNAを抽出してcDNAを調製した。RT-PCRによりGpr55の発現を解析すると、Gpr55は脳にも発現はしていたが、その発現量は低いものだった。精巣、消化管（小腸、大腸）、リンパ節、脾臓などに高発現していた。２）精巣のGpr55の発現分布 マウス臓器の中で精巣がいちばんGpr55を高発現していた。精細管をコラゲナーゼとヒアルロニダーゼで処理して、培地中でシャーレで培養した。シャーレに結合した体細胞（セルトリ細胞など）と結合しなかった精子形成細胞（生殖細胞）を分離した。Gpr55は体細胞と生殖細胞の両方に存在し、特に体細胞に高発現していた。３）脾臓の分画とGpr55の発現解析 脾臓の細胞をばらばらにした後、Tリンパ球、Bリンパ球、マクロファージ、樹状細胞フローサイトメーターで分画した。Gpr55はTリンパ球、Bリンパ球、樹状細胞に発現したが、マクロファージには発現しなかった。４）Gpr55の消化管での分布 腸管を大腸、小腸、十二指腸、空腸、回腸に分画した。腸管の各部位にGpr55は広く分布していた。小腸をPercollを用いて分画するとGpr55は上皮内リンパ球に多く発現した。これらの知見は「Gpr55は炎症・免疫細胞に発現し、炎症・免疫に関与する」ことを示すと考えられる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
1)免疫細胞のどの細胞にGPR55が発現しているか？免疫細胞のどの機能にLPI-GPR55が関与しているか？ 脾臓の細胞を分画し、GPR55がリンパ球や樹状細胞に発現していることを確認している。免疫細胞の様々な免疫プロセスのどのステップにLPI-GPR55が関与しているかを検証する。白血球の分化、増殖、細胞接着、走化性、浸潤、貪食、サイトカイン産生、分泌、脱顆粒、イムノグロブリンの産生などに対するLPIの効果やアンタゴニストの作用を調べる。
2)LPI-GPR55のコンカナバリンA（ConA）誘発性肝炎への影響 急性肝障害の実験動物モデルとして、ConA 誘導性肝炎 に対する影響を調べる。ConAをマウスに投与すると、ConA は類洞内皮細胞やクッパー細胞表面の糖タンパク質とT細胞の表面のT細胞受容体を架橋し、T細胞を活性化する。活性化T 細胞はインターフェロンγや腫瘍壊死因子αなどのサイトカインを放出し肝炎を誘導する。GPR55のKOマウスで同様の実験を行い、野生型マウスに比べて障害の程度が比べて、GPR55の関与を検証する。ConA投与後の肝臓 のT細胞の活性化状態を、CD69 及び CD25抗体を用いたフローサイトメーターで解析する。
3)ConA誘発性肝炎における新規LPIの産生機構について 私たちは細胞内でLPIを産生する酵素として、ホスホリパーゼA1（DDHD1）を同定している。肝炎に関与するLPI産生酵素は細胞外に存在する可能性を考察した。マウスにヘパリンを投与すると血中にLPIが大量に生成することを確認している。また、ヘパリンを投与しておくとConAによる肝炎が起こらないことが知られている。これらの結果は、類洞の血管壁のへパラン硫酸に結合している肝性リパーゼがLPI産生を担う可能性を示している。
|
