| 研究課題/領域番号 |
22K06617
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分47030:薬系衛生および生物化学関連
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
板部 洋之 昭和大学, 薬学部, 教授 (30203079)
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| 研究分担者 |
小濱 孝士 昭和大学, 薬学部, 准教授 (60395647)
牧山 智彦 昭和大学, 薬学部, 講師 (60733102)
渡邉 雄一 昭和大学, 薬学部, 助教 (70792729)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | 細胞内脂肪滴 / Sar1 / COPⅡ小胞 / PLIN2 / 中間比重粒子 / LC-MS/MS |
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| 研究開始時の研究の概要 |
脂肪滴の形成における小胞体からの出芽過程は、まだよく分かっていない。最近、COPⅡ小胞の形成に関わる低分子量Gタンパク質Sar1bが脂肪滴形成を促進することを見出した。そこで、脂肪滴の出芽過程で、Sar1bを含む種々タンパク質による複合体が形成される可能性を考えた。Sar1bを免疫沈降しプロテオーム解析によりSar1bのパートナー分子を探索し、候補分子をshRNA法で発現抑制してその機能を確認する。小胞体からの脂肪滴の出芽機構を解明し、細胞内脂質代謝制御の基盤となる小胞体膜及び脂肪滴の挙動の理解を目指す。
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| 研究実績の概要 |
細胞内脂肪滴は、細胞の種類により大きさや数に多様性が見られるが、このような多様な脂肪滴の状態がどのようにして決められているのか、まだ分かっていない。脂肪滴の形成についてこれまでに、脂肪の供給が十分な場合に脂肪滴の形成は小胞体膜上で起こり、小胞体でのトリアシルグリセロール（TG）の合成が亢進すると、小胞体膜中でTGが集積したレンズ様構造ができ、さらにseipinとLDAF1の2つのタンパク質の作用で小胞体膜から分離して脂肪滴が形成されることが分かってきている。しかし、最も主要な脂肪滴安定化タンパク質であるPLIN2を含めて、多くの脂肪滴タンパク質がどうやって脂肪滴に集まるのかはわかっていなかった。
本研究では、COPⅡ小胞の形成に関わる低分子量Gタンパク質Sar1bが脂肪滴へのPLIN2局在に関わることを見出した。Sar1bの過剰発現細胞及びドミナントネガティブ体を発現させて作用を抑制した細胞を作成した。過剰発現したSar1bは細胞内脂肪滴に局在したが、Sar1bのドミナントネガティブ体（Sar1b G79H）を発現させるとPLIN2の脂肪滴局在が抑制され、細胞内の発現量も減少した。これらの結果から、PLIN2を脂肪滴に局在させる過程にSar1bが関わっていることが示され、既に論文で発表した。
さらに、多くの細胞小器官の膜系が激しく変動する細胞分裂時に、細胞内脂肪滴はどのように変化するのかについて検討した。細胞分裂期には、核やゴルジ体は細かく分裂した小胞となり、一旦消失した細胞小器官は分裂後に再び形成される。ところが、肝細胞核HuH7細胞においては、細胞分裂期の間も脂肪滴は存在し続け、双極性紡錘体の外周部に分布することが見いだされた。このような細胞内脂肪滴の挙動は、他の細胞小器官と明らかな違いを見せており、ことなる制御のされ方をしていることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究1年目に、PLIN2の脂肪滴移行を制御する因子としてSar1bの作用を明らかに出来た。PLIN2 にはシグナル配列が存在しないため、細胞質のポリソームで翻訳され、細胞質から脂肪滴に移行すると推定されていた。今回、小胞体-ゴルジ体間の小胞輸送に関わる因子が脂肪滴タンパク質の移行過程にも関わることが示され、脂肪滴形成と小胞輸送系とのクロストークが示唆された。
2年目には、細胞分裂期の脂肪滴の挙動を検討した。細胞分裂期には、核やゴルジ体は分裂して細かい小胞となり、一旦消失した細胞小器官は分裂後に再び形成される。また、細胞内に多数存在する小胞体やミトコンドリアも細胞分裂時には細かく小胞に分かれて、2つの娘細胞に分配されていくことが知られている。一方、脂肪滴の分裂期の挙動について良く分かっていなかった。ヒト肝がん由来細胞株HuH7を用い、CDK1阻害剤Ro-3306処理でG2/Mチェックポイントで細胞周期を停止させておいてから、培地交換をして同時にM期に進入させた。分裂開始前の細胞では、脂肪滴は細胞質全体に広がって分布していた。細胞分裂の前中期になると、核膜が崩壊し双極性紡錘体が形成され、染色体が赤道面に並ぶ。この時期に、細胞内脂肪滴は紡錘体内には存在せず、孫外側に局在するようになった。脂肪滴の増減や小型化は認められなかった。分裂後期には染色体が両極側に移動するが、この時期に脂肪滴は両極の星状体の背後に集まる傾向がみられた。この間、PLIN2は脂肪滴周囲に存在していたが、細胞内の発現量が減少していることが見いだされた。一方、PLIN3 は細胞内の存在量には変動がなく、細胞分裂期の脂肪滴上では、脂肪滴タンパク質の割合が変動していることが示された。
これらの結果は論文で発表した。（Makiyama T, et al. Exp. Cell Res. 2023, 433:113855）
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| 今後の研究の推進方策 |
令和6年度は、細胞分裂時の脂肪滴の変動、つまり細胞内の位置の変動や脂肪滴上のタンパク質パターンが変動する要因を明らかにするため、以下の点について検討を試みる。①細胞分裂期に脂肪滴を移動させている機構について。予備的な検討では、微小管の形成を阻害するノコダゾール添加により細胞分裂を止めても、脂肪滴の細胞周辺部への局在は維持されたと考えられたので、キネシン、ダイニンなどのモータータンパク質の影響を確かめる。また、脂肪滴とチューブリンとが結合している可能性があるか、検討する。②細胞分裂期にPLIN2、PLIN3 などの構成タンパク比が変動した 脂肪滴に変化していることについて。の発現変動が引き起こされる機構について。PLIN2 のshRNAで発現抑制して、脂肪滴上でPLIN3 優勢となった細胞の作製を試みて、その細胞における脂肪滴の挙動を調べる。③一過的な変動時の脂肪滴の性情を調べる目的で、HuH7細胞に脂肪酸とグルカゴン刺激で脂肪滴を蓄積させたときに生成する中間比重粒子（Takahashi K, et al. J. Lipid Res. 2010, 51: 2571-2580）との比較を試みる。中間比重粒子を回収して、そのプロテオーム解析をして、PLIN2 の挙動を調べる。
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