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ネクロプトーシスの脂質性制御とセラミド分子認識の解明

研究課題

研究課題/領域番号 22K06623
研究種目

基盤研究(C)

配分区分基金
応募区分一般
審査区分 小区分47030:薬系衛生および生物化学関連
研究機関摂南大学

研究代表者

北谷 和之  摂南大学, 薬学部, 准教授 (40539235)

研究分担者 伊藤 潔  摂南大学, 薬学部, 教授 (50201926)
重田 昌吾  東北大学, 医学系研究科, 助教 (90842633)
研究期間 (年度) 2022-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス 交付 (2023年度)
配分額 *注記
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
キーワードセラミド / ネクロトーシス / MLKL / スフィンゴ脂質 / 細胞死 / 脂質生物学 / ネクロプトーシス / がん
研究開始時の研究の概要

ネクロプトーシスは、新たに発見されたプログラム化ネクローシスであり、制御分子RIPK3や実行分子MLKLが同定されている。申請者は、スフィンゴ脂質セラミドが新たなMLKLの直接的な制御分子である可能性を見出した。セラミドは細胞内標的タンパク質の活性化を制御することで、多彩な生物活性を示すことが報告されているが、その制御メカニズムの分子機序(セラミド分子認識機序)は不明である。当研究では、MLKL・セラミド分子認識機序を解明し、セラミドのネクロプトーシス誘導機序を明らかにする。さらに、この分子認識機序を基盤にしてセラミド生物学の分子基盤を創生する。

研究実績の概要

ネクロプトーシスは、新たに発見されたプログラム化ネクローシスであり、制御分子RIPK3や実行分子MLKL(mixed lineage kinase domain-like)が同定されている。これまでにスフィンゴ脂質セラミドが新たなMLKLの直接的な活性化分子である可能性を見出し、この機序解明に挑んでいる。
本課題では、セラミドが細胞内標的タンパク質MLKLの活性化を制御する分子機序の解明を試みている。2023年度では、MLKL・セラミド分子認識機序の解明を目指した結果、次の研究成果を得た:1)fatブロット法を用いて、MLKLに結合するセラミド分子種の同定、2)セラミドのMLKLオリゴマー化への関与。
1)まず、タンパク質を精製するために、HEK293T細胞にV5-tagged MLKL、V5-tagged欠損変異体MLKL(1-371)を過剰発現させた後、Hisカラムを用いて精製した。疎水性メンブランに各種のセラミド分子種をスポットした後、精製タンパク質水溶液と保温した。その結果、長鎖セラミドではなく、極長鎖セラミドが選択的に完全型MLKLタンパク質と相互作用することが判明した。一方で、1-371欠損変異体にはいずれのセラミド分子種も相互作用しなかった。
2)極長鎖セラミド分子種はMLKLと相互作用することから、これらセラミド分子種のMLKLのオリゴマー化への作用を無細胞系において解析した。上記で精製したMLKLタンパク質の水溶液に各種セラミド分子種を加え、一定時間保温した。その結果、極長鎖セラミドはMLKLのオリゴマー化を促進したが、長鎖セラミドではオリゴマー化は見られなかった。
以上の結果から、極長鎖セラミドはMLKLと相互作用する分子であり、この相互作用がMLKLのコンフォメーション変化を来すものと考えられる。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

計画通り、MLKLと相互作用するセラミド分子種を同定できたことから、概ね順調に進んでいる。一方で、この相互作用を、BiacoreT200 を用いて解析する準備を整えていたが、当実験を中止する方向で進めている。

今後の研究の推進方策

セラミド分子種とMLKLの相互作用の可能性を示唆する研究成果を得られた。現在、この生物学的な意義を探索中である。当研究のゴールは研究課題実施期間内に研究成果を国際誌に発表することである。このため、BiacoreT200 を用いた相互作用解析を中止する。これにより生じるエフォートならびに研究費を生物学的意義の解明に注ぐ。

報告書

(2件)
  • 2023 実施状況報告書
  • 2022 実施状況報告書
  • 研究成果

    (7件)

すべて 2024 2023 2022 その他

すべて 国際共同研究 (2件) 雑誌論文 (1件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (4件) (うち招待講演 2件)

  • [国際共同研究] University of Virginia/Stony Brook University(米国)

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [国際共同研究] Stony Brook University/University of Virginia(米国)

    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [雑誌論文] Pronecroptotic Therapy Using Ceramide Nanoliposomes Is Effective for Triple-Negative Breast Cancer Cells2024

    • 著者名/発表者名
      Ohya Yuki、Ogiso Yuri、Matsuda Masaya、Sakae Harumi、Nishida Kentaro、Miki Yasuhiro、Fox Todd E.、Kester Mark、Sakamoto Wataru、Nabe Takeshi、Kitatani Kazuyuki
    • 雑誌名

      Cells

      巻: 13 号: 5 ページ: 405-405

    • DOI

      10.3390/cells13050405

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [学会発表] スフィンゴ脂質セラミドによるネクロプトーシスの誘導2023

    • 著者名/発表者名
      北谷和之
    • 学会等名
      2023年度 第2回Ocular Scientific Meeting(眼科創薬研究会)
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 極長鎖セラミドによる細胞死制御2023

    • 著者名/発表者名
      小木曽悠里,山澤龍治,松田将也,山地俊之,花田賢太郎,坂本 渉,Daniel Canals,Yusuf A. Hannun,伊藤 潔, 奈邉 健,北谷和之
    • 学会等名
      セラミド研究会・スフィンゴテラピイ研究会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 非アポトーシス型の制御性細胞死と脂質性制御2023

    • 著者名/発表者名
      北谷和之
    • 学会等名
      第1回Ocular Scientific Meeting
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 極長鎖セラミド依存的なネクロプトーシスの誘導2022

    • 著者名/発表者名
      北谷和之,小木曽悠里,山澤龍治,伊藤 潔,松田将也,山地俊之,花田賢太郎, 坂本 渉,Daniel Canals,Yusuf A. Hannun,奈邉 健
    • 学会等名
      セラミド研究会・スフィンゴテラピイ研究会(札幌)
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書

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公開日: 2022-04-19   更新日: 2024-12-25  

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