| 研究課題/領域番号 |
22K06646
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分47040:薬理学関連
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
黒瀬 等 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 徳島大学専門研究員 (10183039)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | 受容体 / Gタンパク質 / シグナリング / G12ファミリー / がん化 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
G12ファミリーのGタンパク質（G12とG13)をそれぞれノックアウトしたマウスは、G12ノックアウトマウスは成長していくのに、G13は胎生致死であった。また、G12とG13はがん化のシグナルを活性化するとの報告もなされている。G12とG13に独自のシグナルを明らかにすることで、がん化の新しいメカニズムを見出すことができるのではと考えている。そこで、G12とG13を選択的に活性化するデザイナー受容体、リン酸化プロテオミクスなどの手法を用いて、G12とG13が選択的に活性化するシグナルを明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
Gタンパク質は細胞外のシグナルを細胞内に伝える仲介因子として知られている。Gs、Gi、GqおよびG12の4つのグループに分けられる。Gsはアデニル酸シクラーゼの活性化、Giはアデニル酸シクラーゼの抑制、GqはホスホリパーゼCの活性化G12ファミリーはRhoAの活性化を、それぞれ引き起こすと考えられている。G12ファミリーにはG12とG13が含まれている。いずれもRhoAを活性化するものの、in vivoではお互いの機能を相補しないため、RhoA以外のシグナル経路も活性化していると考えられている。すなわちG12とG13はRhoA以外の独自のシグナル経路を活性化していると想定されている。本研究では、G12とG13独自のシグナル経路を、リン酸化プロテオミクスの手法を用いて明らかにすることを目的としている。G12とG13を選択的に活性化するためにクロザピン-N-オキシド（CNO）のみをアゴニストとするデザイナー受容体を用いる。G12選択的デザイナー受容体は作製していることから、G12選択的シグナルの解析を開始した。HEK293A細胞にG12選択的デザイナー受容体を発現させ、CNOで刺激し反応を停止させた後、リン酸化されたペプチドを質量分析にて解析した。G12選択的デザイナー受容体はG12以外にもGqを活性化することから、Gqシグナルの関与はGq阻害剤（YM-254890）を添加することで除く必要がある。また、G12およびG13はRhoAを活性化することから、RhoAキナーゼが共通に活性化されていると考えられている。したがって、RhoAキナーゼ以外でリン酸化されたシグナリング分子を同定することで、G12およびG13選択的シグナリングを明らかにできると考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
G12選択的なシグナリング経路としてPKGやPKAを活性化する経路を示す結果を得ている。これまで、G12ファミリーの下流で活性化されるシグナリングについては、RhoA以外の経路は解析されてこなかったため、PKGやPKAの活性化は新たな経路として提唱できると考えている。G12ファミリーは細胞増殖（がん化を含む）にも関わっていることから、新たなシグナリング経路はがん化のメカニズム解明に貢献できると考えているため、おおむね順調に進展していると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の実験を箇条書きにした。(1)Gq阻害剤の添加でのリン酸化プロテオミクスを実施する。プロテオミクスは些細なことで結果が大きく振れるため、数回の実験を行い、再現性を確認する。(2)G12ファミリーが影響を与えるRhoA以外のシグナリング分子として、ホスファターゼ5とインテグリンが報告されている。したがって、これらシグナリング分子の阻害剤を添加し、同定したシグナリング分子（PKGやPKA）のリン酸化活性がどのように影響を受けるか検討する。(3)今回同定したシグナリング分子はプロテインキナーゼAプロテインキナーゼGであり、これまでG12の下流で解析されてこなかった。さらに、どのようにG12からプロテインキナーゼへのシグナルが伝達されているのかも未知である。サイクリックヌクレオチド依存性のタンパク質リン酸化酵素（PKGやPKA）がサイクリックヌクレオチドを介さずに活性化されているならば、新しいシグナリング経路として提唱できる。(4)重要な点はHEK293A細胞を用いたin vitroの結果がin vivoでも活性化されていることを示す必要がある。今回同定したG12選択的シグナリングがin vivoでも活性化されていることを示すため、ゼブラフィッシュに発現させ、RNAiを用いたノックダウンや阻害剤を用いた実験を行い確認できないかと考えている。
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